王暉 天津市水閣醫(yī)院 （天津 300090）

內(nèi)容提要： 高通量測(cè)序技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的新型DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)于新生兒遺傳性疾病的診治具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此本文對(duì)近些年關(guān)于高通量測(cè)序在新生兒遺傳性疾病診治中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期提高臨床新生兒遺傳性疾病的整體醫(yī)療水平。

高通量測(cè)序又被稱之為下一代測(cè)序或者大規(guī)模平行測(cè)序，是近些年發(fā)展起來(lái)的新型DNA測(cè)序技術(shù)[1]。該技術(shù)可以同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)的DNA分子開展平行測(cè)序，已經(jīng)成為當(dāng)年遺傳性疾病診斷的主要方法，其主要技術(shù)優(yōu)勢(shì)為高通量和敏感性[2]。該技術(shù)為新生兒遺傳學(xué)疾病的診治提供了新思路，有助于對(duì)那些疑似遺傳性疾病的危重新生兒提高診療準(zhǔn)確性和有效性。本文對(duì)近些年關(guān)于高通量測(cè)序在新生兒遺傳性疾病診治中的應(yīng)用進(jìn)行綜述如下。

1.高通量測(cè)序技術(shù)

美國(guó)ABI高通量測(cè)序技術(shù)的核心為四種基于熒光標(biāo)記的寡核苷酸的連接反應(yīng)。在高通量測(cè)序之前，需要構(gòu)建文本庫(kù)以及采用乳化PCR進(jìn)行擴(kuò)增，以8個(gè)堿基熒光探針混合物作為連接測(cè)序的底物，樣品DNA按照序列位置被探針?biāo)鶚?biāo)記，在測(cè)序過(guò)程中DNA連接酶首先選擇與模板相匹配的探針進(jìn)行連接，引發(fā)該探針位置處產(chǎn)生熒光信號(hào)。高通量測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)為讀長(zhǎng)僅為50～75bp，精確度高達(dá)Q40，對(duì)于單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)以及基因組重測(cè)序特別適用[3]。同時(shí)ABI高通測(cè)序儀在測(cè)序過(guò)程中對(duì)于每個(gè)堿基判讀重復(fù)兩次，有效降低了原始數(shù)據(jù)讀取錯(cuò)誤，采用連接酶取代傳統(tǒng)的聚合酶，有效降低了堿基錯(cuò)配失誤，同時(shí)在測(cè)序過(guò)程中加入了更換引物，能夠有效提高測(cè)序精度。

高通量測(cè)序技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，根據(jù)其測(cè)序覆蓋范圍可以將高通測(cè)序技術(shù)分為WGS、全外顯子組測(cè)序以及靶向目標(biāo)基因測(cè)序三種類型。WGS高通測(cè)序技術(shù)主要是對(duì)針對(duì)基因組水平的變異性進(jìn)行檢測(cè)，但是費(fèi)用昂貴，目前還未能在實(shí)驗(yàn)室得到推廣應(yīng)用。全外顯子組測(cè)序的臨床診斷可行性已經(jīng)被證實(shí)，而且在遺傳性疾病的診斷方面已經(jīng)表現(xiàn)出了巨大優(yōu)勢(shì)，在疾病基因研究以及分子標(biāo)志物研究方面起到了積極的促進(jìn)作用[4]。靶向目標(biāo)基因測(cè)序可以有效發(fā)揮高通量測(cè)序技術(shù)針對(duì)遺傳病診療方面的優(yōu)勢(shì)，克服WGS和全外顯子組測(cè)序過(guò)程中大數(shù)據(jù)對(duì)下游生物信息學(xué)解析的干擾，適用于臨床試驗(yàn)組對(duì)遺傳性疾病開展分子診斷。

2.高通量測(cè)序在新生兒遺傳性疾病中的應(yīng)用

遺傳性疾病在臨床上通?？梢苑譃槲宸N類型，分別為單基因遺傳性疾病、多基因遺傳性疾病、染色體病、基因組印記以及線粒體病。目前遺傳性疾病在新生兒科中特別常見(jiàn)，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前僅中國(guó)就有大約1000萬(wàn)罕見(jiàn)遺傳病患兒，同時(shí)每年新出生存在缺陷的患兒約有90萬(wàn)。

2.1 高通量測(cè)序在遺傳代謝性疾病中的應(yīng)用

近年來(lái)國(guó)內(nèi)的很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)開始采用高通量測(cè)序輔助遺傳代謝性疾病的診斷。楊琳等基于Ion Torrent PGM?平臺(tái)分別對(duì)1例膽汁酸合成障礙患兒、1例甲基丙二酸血癥患兒采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果均與實(shí)際驗(yàn)證一致。而且測(cè)序操作簡(jiǎn)單方便，時(shí)間較短，結(jié)果直觀[5]。郝虎等選取10例經(jīng)經(jīng)GC-MS/MS檢測(cè)的疑似陽(yáng)性遺傳代謝性疾病患兒作為研究對(duì)象開展高通量測(cè)序工作，結(jié)果顯示有8例患兒得到確診，其中有3例患兒檢測(cè)結(jié)果得到準(zhǔn)確分型，這為疾病后續(xù)的治療和管理提供了依據(jù)[6]。韓國(guó)曾選取269例新生兒疾病篩查結(jié)果顯示為陽(yáng)性的患兒開展高通量測(cè)序，對(duì)97個(gè)基因突變情況進(jìn)行了篩查，結(jié)果顯示有20%的患兒被確診為遺傳代謝性疾病，并且通過(guò)此次研究發(fā)現(xiàn)了新的能夠預(yù)防的遺傳代謝性疾病患兒，可以通過(guò)采取早期的干預(yù)措施來(lái)避免造成嚴(yán)重的后果。

2.2 高通量測(cè)序在先天性畸形中的應(yīng)用

2015年，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院與美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院合作，共同建立了一套系統(tǒng)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析以及臨床診斷流程，具體內(nèi)容包括測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理、變異檢測(cè)、變異注釋以及篩選和分類等?；谶@套高通量測(cè)序分析診斷流程，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院對(duì)87例多發(fā)畸形新生兒開展了高通量測(cè)序，取得了較為理想的效果，該流程的靈敏度以及特異度均高于96.7%。Lim等在2015年選取15例具有先天性缺陷的患兒為研究對(duì)象，基于目標(biāo)基因探針捕獲技術(shù)開展基因檢測(cè)，共有6例患兒被檢測(cè)出存在致病基因，疾病檢出率為40%，該研究表明對(duì)存在致病基因的患兒，該技術(shù)在檢測(cè)時(shí)間、分析難度以及檢測(cè)成本等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Carss選取30例孕婦基因開展高通量測(cè)序，結(jié)果顯示該技術(shù)能夠有效檢測(cè)導(dǎo)致胎兒發(fā)生畸形的基因突變。

3.結(jié)束語(yǔ)

高通量測(cè)序技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的新型DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)于新生兒遺傳性疾病的診治方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。采用高通量測(cè)序技術(shù)不僅可以對(duì)文中所述的遺傳代謝性疾病和先天性畸形進(jìn)行檢測(cè)，還可以血液系統(tǒng)疾病以及其他遺傳性疾病進(jìn)行檢測(cè)。雖然當(dāng)前技術(shù)在推廣應(yīng)用中還不夠成熟，相信隨著后續(xù)的進(jìn)一步研究，高通量測(cè)序?qū)?huì)為新生兒遺傳性疾病診斷提供更為可靠的基因檢測(cè)結(jié)果。