楊映暉 伍定輝 蘇偉明 董春萍 姚向陽(yáng)

隨著對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制研究的深入，多種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的檢測(cè)方法相繼出現(xiàn)?；蛐酒ㄊ墙陙?lái)在醫(yī)療領(lǐng)域最具影響力的科技發(fā)展成果之一，可快速檢測(cè)臨床疑似標(biāo)本中的分枝桿菌屬DNA。本研究采用前瞻性的方法，通過(guò)對(duì)患者同一份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行基因芯片法、GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱(chēng)“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及其比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“MGIT 960培養(yǎng)及其比例法藥敏試驗(yàn)”)3種方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因rpoB、katG及inhA的檢測(cè)，并對(duì)3種檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討基因芯片檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和不足。

資料和方法

一、資料收集

采用前瞻性的方法，收集2017年6月至2018年6月廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺科門(mén)診及住院的疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本。標(biāo)本采用患者晨痰，同一份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行基因芯片法、GeneXpert法和MGIT 960培養(yǎng)及其比例法藥敏試驗(yàn)3種方法進(jìn)行檢測(cè)。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[1]。本研究收集933例患者的晨痰標(biāo)本；其中，男674例，女259例；年齡11～84歲，中位年齡56歲。

二、儀器與試劑

分枝桿菌菌種鑒定芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司；產(chǎn)品貨號(hào)301030)；結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司；產(chǎn)品貨號(hào)301035)；Extractor 36核酸快速提取儀(博奧生物集團(tuán)有限公司)；LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀及配套儀器(博奧生物集團(tuán)有限公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)儀(美國(guó)Cepheid 公司)；結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測(cè)試劑盒(Cepheid AB 瑞典賽沛公司；產(chǎn)品貨號(hào)1000061494)；BACTEC MGIT 960全自動(dòng)培養(yǎng)儀(美國(guó)BD公司)；分枝桿菌藥物敏感性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

三、菌種及耐藥基因檢測(cè)

(一)基因芯片法檢測(cè)

1.標(biāo)本制備及核酸提取：痰標(biāo)本加入等量10% NaOH溶液，振蕩液化15～20 min，以3035×g離心5 min，離心后棄上清。再加入1 ml生理鹽水，充分振蕩后以12 830×g離心5 min，離心后棄上清。向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液，加入上述標(biāo)本后，使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃水浴5 min，再以8910×g離心1 min。

2.PCR擴(kuò)增：采用不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增法對(duì)相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。分別采用PCR擴(kuò)增試劑1、2、3對(duì)每份樣品進(jìn)行3管PCR擴(kuò)增反應(yīng)。分別向3管中加入2 μl模板DNA和18 μl PCR擴(kuò)增試劑。每管PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：37 ℃激活10 min；94 ℃變性600 s；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃ 420 s。

3.芯片雜交與結(jié)果判讀：擴(kuò)增反應(yīng)完成后，在利福平芯片雜交管中加入3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1、3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物2和9 μl雜交緩沖液，在異煙肼芯片雜交管加入3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1、3 μl擴(kuò)增產(chǎn)物3和9 μl雜交緩沖液。15 μl雜交反應(yīng)混合物于95 ℃變性5 min，后立即冰水浴3 min。吸出13.5 μl雜交反應(yīng)混合物加入芯片陣列，再置于50 ℃雜交儀中雜交120 min。雜交后經(jīng)洗滌甩干后使用LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯軟件進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果的判讀。

(二)MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)

取4倍體積的4% NaOH溶液溶于痰標(biāo)本中，旋渦振蕩混勻，使痰標(biāo)本充分液化，靜置15 min，以3035×g離心5 min，棄上清后中和，用一次性無(wú)菌吸管吸取處理后的痰標(biāo)本0.5 ml，接種于液體培養(yǎng)管中，加載到BACTEC MGIT 960全自動(dòng)培養(yǎng)儀上。培養(yǎng)陽(yáng)性后，通過(guò)萋尼抗酸染色確定是否培養(yǎng)出抗酸桿菌；取陽(yáng)性菌株接種于羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，并接種噻吩-2-羧酸肼和對(duì)硝基苯甲酸鑒別培養(yǎng)基，鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌。比例法藥敏試驗(yàn)：挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌菌落，用滅菌生理鹽水配制1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，然后使用無(wú)菌的10 μl標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)，進(jìn)行100倍和10 000倍稀釋?zhuān)?0 μl無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別挑取10 000倍稀釋菌懸液一環(huán)，劃線接種于一組空白對(duì)照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，再用10 μl無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別挑取100倍稀釋菌懸液一環(huán)，劃線接種于另外一組空白對(duì)照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，擰緊培養(yǎng)基管蓋，豎直置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察記錄藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

(三)GeneXpert檢測(cè)

將痰標(biāo)本與消化液以1∶2的比例加入15 ml無(wú)菌干燥離心管中，振蕩，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。使用與GeneXpert MTB/RIF樣品盒配套的一次性移液管，將2 ml處理后的樣品加至樣品盒中，將樣品盒掃描二維碼，錄入信息，放入GeneXpert MTB/RIF儀器中，2 h后讀取記錄檢測(cè)結(jié)果。

四、質(zhì)量控制

所有參加本研究的工作人員均接受?chē)?yán)格、系統(tǒng)的培訓(xùn)并掌握實(shí)施方案，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)納入患者，完成各項(xiàng)操作，進(jìn)行結(jié)果判斷。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均做陰性、陽(yáng)性質(zhì)量控制。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“率(%)”描述，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75為兩者一致性較好，0.4≤Kappa值<0.75為兩者一致性一般，Kappa值<0.4為兩者一致性較差。各百分率的95%CI采用OpenEpi 3.01軟件進(jìn)行計(jì)算。

結(jié) 果

一、基因芯片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥的效能

933例患者的痰標(biāo)本中，基因芯片法檢測(cè)出陽(yáng)性484例，GeneXpert檢測(cè)出陽(yáng)性462例，MGIT 960培養(yǎng)出陽(yáng)性411例。3種檢測(cè)方法均為陽(yáng)性的標(biāo)本有395例，從3種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的標(biāo)本中通過(guò)Excel表以完全隨機(jī)的方式抽取232份分別進(jìn)行異煙肼耐藥基因katG及inhA檢測(cè)。以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測(cè)出異煙肼耐藥的敏感度為86.67%(26/30)，特異度為96.53%(195/202)，一致性達(dá)95.26%(221/232)，Kappa值為0.798(0.682～0.914)，具有良好的一致性(表1)。

二、基因芯片法和GeneXpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥的效能

分別采用基因芯片法和GeneXpert進(jìn)行利福平耐藥基因rpoB檢測(cè)，同樣以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測(cè)出的利福平耐藥敏感度為93.75%(30/32)，特異度為97.00%(194/200)，一致性達(dá)96.55%(224/232)，Kappa值為0.862(0.768～0.956)，兩者具有良好的一致性(表2)。

以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)出的利福平耐藥敏感度為84.38%(27/32)，特異度為97.00%(194/200)，一致性達(dá)95.26%(221/232)，Kappa值為0.803(0.691～0.915)，兩者具有良好的一致性(表2)。

表1 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷基因芯片法檢測(cè)異煙肼耐藥性的效能

表2 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷基因芯片法與GeneXpert檢測(cè)利福平耐藥性的效能

表3 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷基因芯片法與GeneXpert檢測(cè)利福平耐藥一致性的比較

將基因芯片法與GeneXpert進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)出的利福平耐藥陽(yáng)性一致性為90.91%(30/33)，陰性一致性為96.98%(193/199)，總一致性達(dá)96.12%(223/232)，Kappa值為0.847(0.749～0.945)，具有良好的一致性(表3)。

討 論

耐藥結(jié)核病是重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，為控制結(jié)核病的一大障礙[2]。盡早掌握結(jié)核分枝桿菌耐藥狀況及影響因素，可提高耐藥結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)和治療能力[3]，對(duì)減少耐多藥結(jié)核病的傳播具有重大意義[4]。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室迫切需要開(kāi)發(fā)特異度和敏感度高、檢測(cè)速度快的檢測(cè)方法。

目前，最普遍使用并被視為診斷結(jié)核病參考標(biāo)準(zhǔn)的MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)，存在操作繁瑣、陽(yáng)性率低、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)和生物安全性差等問(wèn)題，明顯滯后于結(jié)核病早期診斷的期望[5]，無(wú)法滿(mǎn)足臨床快速診斷的需求。近幾年，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)成為結(jié)核病快速診斷的主要手段[6]。其中基因芯片技術(shù)敏感、準(zhǔn)確且簡(jiǎn)便可靠，可以同時(shí)檢測(cè)到多種靶基因，如異煙肼耐藥基因katG和inhA基因啟動(dòng)子及利福平耐藥基因rpoB等常見(jiàn)突變位點(diǎn)。該檢測(cè)手段所需樣本量少、準(zhǔn)確、信噪比極小且易于操作，開(kāi)辟了新的臨床診斷視野。

本研究將基因芯片法與GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)進(jìn)行了深入比較，在結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)及結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)方面具有良好的敏感度和特異度?；蛐酒ńY(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果具有良好的一致性，并且彌補(bǔ)了后者耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、占用實(shí)驗(yàn)室空間的缺陷；與GeneXpert方法比較，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但GeneXpert只能檢測(cè)一種耐藥基因(rpoB)，基因芯片技術(shù)能一次檢測(cè)katG、inhA和rpoB3種耐藥基因，對(duì)耐多藥結(jié)核病的快速診療更有應(yīng)用價(jià)值。代小偉等[7]、許榕青等[8]和王小路等[9]的研究結(jié)果也均顯示基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)，與本研究所獲得的結(jié)果基本一致。

但是，每種方法都有各自的局限性，與其設(shè)計(jì)原理、操作復(fù)雜性及結(jié)果判讀偏倚等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，基因芯片法和GeneXpert在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性例數(shù)方面，與MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)方法存在部分差異。分析可能的原因是：結(jié)核分枝桿菌的檢出結(jié)果受多種因素限制，如細(xì)菌代謝及繁殖是否旺盛，是否處于休眠狀態(tài)，是否存在形態(tài)多樣性等因素[10]。結(jié)核分枝桿菌處于休眠或者衰亡狀態(tài)，就可能出現(xiàn)培養(yǎng)陰性的情況。同時(shí)也突顯出當(dāng)今分子診斷技術(shù)普遍存在的不足之處，即不能判斷結(jié)核分枝桿菌是否是具備傳染性的活菌，不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)所用藥品的療效。所以基因芯片法不能完全取代MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)方法，兩者可以互相補(bǔ)充。

綜上所述，基因芯片法在結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因的檢測(cè)中，具有較高的敏感度和特異度，且檢測(cè)時(shí)間短，與傳統(tǒng)方法相比，具有快速、安全、準(zhǔn)確、有效的特點(diǎn)，有利于耐多藥結(jié)核病的早期診斷及防控，值得在臨床診療中推廣應(yīng)用。