李冰瑩 鄭旭彬 胡屹 徐飚

耐多藥結核病(MDR-TB)流行給全球結核病控制帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。中國是結核病高負擔國家，耐藥率也高于全球平均水平[1]。傳統(tǒng)藥敏試驗(drug-susceptibility testing, DST)通常被視為耐藥結核病診斷的金標準，但該方法耗時較長[2]。GeneXpert、線性探針等分子診斷技術雖能快速診斷耐藥性，但僅能檢測少數藥品最常見的耐藥突變位點，無法提供全面的抗結核藥品耐藥信息[3-4]。隨著高通量測序技術的發(fā)展和測序成本的下降，全基因組測序(whole-genome sequencing, WGS)技術為結核病耐藥檢測提供了新的手段。WGS可以在全基因組水平上同時檢測耐藥基因的變化信息，受到了世界衛(wèi)生組織的肯定，有廣闊的應用前景[5-6]。然而WGS產生的數據量龐大，需要運用復雜的生物信息學才能得到耐藥結果，給臨床實際應用帶來挑戰(zhàn)[7]。因此，WGS的臨床應用必須要借助高效、自動化的信息平臺，從而使非生物信息學專業(yè)的臨床人員可以常規(guī)使用。

最近，研究人員開發(fā)了幾款針對結核分枝桿菌的自動化分析工具，只需導入原始測序數據即可得到藥敏試驗結果，克服了WGS在臨床使用上的限制[8-10]。為了指導臨床診斷和治療，這些分析工具必須要有高度的準確性。但是一方面，已有的研究結果并不一致，芬蘭的研究表明,TB Profiler v2.8.0、Mykrobe v0.7.0和PhyResSE v1.0(以下簡稱“TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE”)診斷MDR-TB的敏感度從74%～80%不等，而一項2019年的研究則顯示診斷MDR-TB的敏感度在90%左右[11-12]。另一方面，不同地區(qū)主要流行菌株不同，耐藥相關基因突變頻率和類型也不同，會導致耐藥檢測的準確性有差異。因此，本研究使用TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE這3種工具對534株中國臨床分離菌株進行耐藥檢測，以更好地評估這些工具的診斷性能。

資料和方法

一、數據來源

在PubMed中利用“whole genome sequencing”“Mycobacteriumtuberculosis”“drug resistance”和“China”等關鍵詞進行組合檢索，篩選2019年5月1日前符合以下納入標準的研究：(1)對4種一線抗結核藥品和至少2種二線抗結核藥品進行了DST；(2)至少對10株結核分枝桿菌菌株進行了測序；(3)均為來自中國的結核分枝桿菌臨床分離菌株；(4)能批量下載測序數據和DST結果。最終篩選得到符合標準的2項研究，并從美國國立生物技術信息中心核酸數據庫(National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive, NCBI SRA)中下載了這2項研究所上傳的534株結核分枝桿菌的全基因組序列[13-14]。534株結核分枝桿菌菌株均為來自中國的臨床菌株，表型藥敏試驗顯示，457株為耐藥菌株，77株為敏感菌株。

二、軟件工具

評估的3種結核分枝桿菌全基因組數據分析工具分別是TB Profiler v2.8.0(http://tbdr.lshtm.ac.uk/)、Mykrobe v0.7.0(https://www.mykrobe.com/)和PhyResSE v1.0(www.phyresse.org)。下文中所涉及的TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE均與此處版本相同。這3種工具都不需要使用命令行界面和編程語言，只需把原始測序數據上傳到網頁或導入軟件即可檢測所有一線抗結核藥品和大多數二線抗結核藥品的耐藥性，具體藥品目錄見表1。

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE操作簡單，給出的耐藥檢測結果簡單易懂，并且給出了菌株家系信息(表2)。在處理時間方面，一個100倍測序深度的樣本(約450兆)使用網頁版TB Profiler和 PhyResSE從上傳完成到得到耐藥結果需要約90 min，而使用軟件版Mykrobe則速度較快，只需要約30 min。在批量操作方面，PhyResSE網頁版提供批量上傳，TB Profiler和Mykrobe只能在命令行版本批量分析數據。此外，TB Profiler和Mykrobe可以根據用戶個性化需求修改使用的突變數據庫，從而納入新發(fā)現的耐藥突變，不斷提高檢測的準確性。TB Profiler在命令行版本中通過編輯源代碼來修改突變數據庫，Mykrobe在命令行版本中通過使用Python代碼生成器進行調整。

三、評價指標

以DST結果為金標準，使用統(tǒng)計軟件R(版本3.1.0)計算敏感度、特異度，包括相應的95%置信區(qū)間。

結 果

一、TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對一線抗結核藥品耐藥的檢測效能

以DST結果為參照標準，Mykrobe和PhyResSE檢測異煙肼耐藥的敏感度分別為76.42%(350/458)和76.20%(349/458)，略高于TB Profiler(69.43%，318/458)，三者特異度幾乎相同(表3)。TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測利福平耐藥的敏感度和特異度均較高，敏感度分別為90.81%(415/457)、87.75%(401/457)和90.81%(415/457)，特異度分別為97.40%(75/77)、96.10%(74/77)和96.10%(74/77)。對于乙胺丁醇，TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE的敏感度相近，分別為81.61%(213/261)、79.31%(207/261)和79.69%(208/261)，三者特異度也相近，在83%左右。對于吡嗪酰胺，TB Profiler的敏感度(72.82%，150/206)高于Mykrobe(61.65%，127/206)和PhyResSE(50.97%，105/206)，三者特異度相近，均高于92%。

表1 3種全基因組數據分析工具檢測藥品種類情況

表2 不同性能在3種全基因組數據分析工具間的比較

表3 以DST為金標準判斷TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對一線抗結核藥品耐藥的檢測效能

二、TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對二線抗結核藥品耐藥的檢測效能

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測二線抗結核藥品耐藥的特異度均較高，而敏感度在不同藥品和工具之間差異較大(表4)。PhyResSE檢測氟喹諾酮類耐藥的敏感度為88.27%(143/162)，略高于TB Profiler(81.48%，132/162)和Mykrobe(82.10%，133/162)。對于阿米卡星，PhyResSE的敏感度為60.00%(27/45)，略高于TB Profiler(48.89%，22/45)和Mykrobe(55.56%，25/45)。TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測耐鏈霉素的敏感度相近，分別為78.77%(256/325)、76.00%(247/325)和79.38%(258/325)。TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測氟喹諾酮類和阿米卡星耐藥的特異度均高于95%，檢測耐鏈霉素的特異度略低，分別為88.89%(184/207)、89.37%(185/207)和90.34%(187/207)。根據DST結果，本研究納入的菌株中有3株耐貝達喹啉、12株耐利奈唑胺和35株耐氯法齊明，TB Profiler對這3種藥品進行了耐藥檢測，但只檢測了Rv0678和rrl基因上少數突變位點，沒有檢出耐藥菌株。

表4 以DST為金標準判斷TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE對二線抗結核藥品耐藥的檢測效能

討 論

快速檢測結核分枝桿菌耐藥性可以指導臨床治療、改善患者預后、降低傳播風險，對于控制結核病至關重要。使用WGS可以在5 d左右獲得耐藥結果，顯著減少了耐藥診斷所需的時間，具有良好的發(fā)展?jié)摿11]。但是WGS數據處理復雜，不利于臨床人員使用，WGS的臨床應用必須要借助高效、自動化的數據分析工具。本研究評估了TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE這3種針對結核分枝桿菌開發(fā)的全基因組數據分析工具的檢測性能，以利于WGS技術在結核病中的應用。結果顯示，TB Profiler、Mykrobe 和PhyResSE總體性能良好，檢測各種藥品耐藥的特異度均較高，但敏感度在不同的藥品和工具之間差異較大，這與先前的研究結果相一致[11,15-16]?？傮w而言，一線抗結核藥品(PZA除外)、氟喹諾酮類藥品和鏈霉素的耐藥檢測敏感度較好，其余藥品敏感度較差。

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE檢測吡嗪酰胺耐藥的敏感度較低的原因不是工具算法無法檢測到菌株的遺傳變異，而是由于分析時只納入了早期研究發(fā)現的耐藥有關的點突變，但是近期研究發(fā)現插入與缺失也是吡嗪酰胺耐藥的重要機制[17]。一項日本的研究表明，通過手動修改TB Profiler等工具的突變數據庫，增加吡嗪酰胺耐藥有關的插入和缺失，可以顯著提高檢測的準確性[18]。手動修改突變數據庫不適用于臨床環(huán)境，因此需要開發(fā)者加快更新速度，及時調整默認的突變數據庫，不斷提高耐藥檢測的準確性。但是由于缺少持續(xù)的資金支持，這些工具的維護和完善面臨挑戰(zhàn)。例如，KvarQ是一款2014年開發(fā)耐藥檢測軟件，但自從開發(fā)之后未曾進行過更新維護，影響用戶使用[19]。因此，可考慮采取可持續(xù)的商業(yè)模式，以確保這些工具的臨床實用性[16]。

TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE中只有TB Profiler對貝達喹啉、利奈唑胺和氯法齊明進行了耐藥檢測，但是卻沒有檢測出耐藥菌株。這主要是由于貝噠喹啉等藥品的耐藥機制尚不清楚，TB Profiler檢測時只納入了Rv0678和rrl基因上少數突變位點，檢測效果差。這提示對于貝達喹啉等敏感度表現不佳的藥品首先要加強耐藥機制研究，獲得高質量的耐藥有關突變，才能提高耐藥檢測的準確性。此外，值得注意的是WGS測序深度也會影響耐藥檢測的敏感度。當菌群中存在敏感菌和耐藥菌混合感染時，表型藥敏試驗能檢測出1%菌群比例的耐藥，而WGS檢測限值與測序深度有關，測序深度較淺時可能會將混合感染的樣本診斷為敏感[20]。

本研究首次針對性地納入中國結核病患者的臨床分離菌株以更好地評估TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE的診斷性能。但本研究也存在一定的局限性。首先，貝達喹啉、利奈唑胺和氯法齊明耐藥菌株數量較少，可能會影響敏感度評估的準確性。其次，本研究中耐藥菌株占比高，不能反映耐藥率水平，因此，無法估計陽性預測值和陰性預測值。

本研究證實了TB Profiler、Mykrobe和PhyResSE這3種針對結核分枝桿菌開發(fā)的全基因組數據分析工具總體性能良好，對于指導臨床用藥有較高價值。但目前還面臨吡嗪酰胺和二線藥品檢測敏感度低等限制，離大規(guī)模臨床應用尚有一段距離，有望在將來徹底改變耐藥結核病的快速臨床診斷。為了確保這些工具的臨床實用性，還需要加強抗結核藥品耐藥機制研究(尤其是吡嗪酰胺和二線藥品)，提高耐藥突變數據庫的質量，從而提高檢測的準確性。