◎ 李花覺

（百色市田陽縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 百色 533600）

為了改善食品的色、香、味和品質(zhì),食品中通常會加入一定量的防腐劑及甜味劑等食品添加劑[1]。為保障人們的健康，國家對相關(guān)食品添加劑都進(jìn)行限量并制定了相應(yīng)的檢測方法，但國家標(biāo)準(zhǔn)方法僅限于各種添加劑的分開測定，大大降低了工作效率，還造成了很多不必要的浪費。本文根據(jù)實驗室現(xiàn)有儀器條件及技術(shù)現(xiàn)狀，結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，考察了流動相的體系、配比、流動相的流速、柱溫、進(jìn)樣量等對測定的影響條件,進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，建立了用超高效液相色譜法同時檢測飲料中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜和咖啡因的檢測方法，該方法具有簡單快捷、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性和選擇性好等特點。

1 實驗部分

1.1 儀器和設(shè)備

Waters ACQUITY H -Class超高效液相色譜儀（配有紫外檢測器、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、高壓泵、Empower3色譜工作站），MICROPURE超純水制備系統(tǒng)（美國塞默飛世爾公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，0.45 μm 濾膜（天津津騰公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備

山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜和咖啡因5種物質(zhì)均為國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測中心出的成品，其原液濃度分別為1.0、1.0、1.0、1.0和0.5 mg·mL-1，根據(jù)需要取一定量的原液混合，并用超純水稀釋成相應(yīng)的質(zhì)量濃度，其中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、咖啡因濃度為1.00、5.00、10.00、15.00 μg·mL-1和 20.00 μg·mL-1， 安 賽 蜜 濃度為 0.50、2.00、4.00、8.00 μg·mL-1和 10.00 μg·mL-1，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待測。

1.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（粒徑1.7 μm，柱內(nèi)徑為2.1 mm×50 mm）；柱溫為35 ℃；室溫為20 ℃；進(jìn)樣量為10.0 μL；紫外檢測器波長為230 nm；流動相A相為甲醇，C相乙酸銨（pH=4.0，濃度為 0.02 mol·L-1）組成；流速為 0.250 mL·min-1，梯度洗脫。

1.4 實驗方法

取飲料試樣適量，置于10.0 mL比色管中（對碳酸飲料樣品先加熱驅(qū)除二氧化碳），分別經(jīng)超聲清洗器超聲20 min后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取濾液至樣品瓶直接進(jìn)行UPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 梯度洗脫條件的選擇

采用甲醇-0.02 moL·L-1乙酸銨溶液（經(jīng)0.45 μm濾膜過濾）體系作為流動相，因國標(biāo)中為單個項目檢測，其采用甲醇-0.02 moL·L-1乙酸銨溶液（5+95）配比的等度洗脫方式，經(jīng)實驗，該條件下5個目標(biāo)峰無法分離。甲醇初始濃度選擇15%時，僅出現(xiàn)4個峰形；經(jīng)改變甲醇初始濃度后，此梯度下5種目標(biāo)峰完全分離且峰型對稱而尖銳。方法選用的梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件表

2.1.2 檢測波長的選擇

按國家標(biāo)準(zhǔn)方法，山梨酸、苯甲酸、糖精鈉均選用230 nm作為檢測波長，安賽蜜為280 nm，咖啡因為214 nm[2-3]。經(jīng)過反復(fù)的實驗發(fā)現(xiàn)，安賽蜜和咖啡因在230 nm均有較大的吸收，固選擇230 nm為本次項目的檢測波長。在此檢測波長下，5種添加劑響應(yīng)值高，背景干擾小。

2.1.3 柱溫的選擇

實驗考察25、30、35 ℃柱溫條件下5種添加劑的分離效果，柱溫升高，目標(biāo)峰的保留時間就會相就的降低，且對系統(tǒng)壓會造成一定的影響。因安賽蜜和糖精鈉在此實驗條件下保留時間相近，柱溫過低將使該兩目標(biāo)峰無法他離，過高則會使目標(biāo)峰接近溶劑倒峰而影響結(jié)果，因此，本次實驗選用35 ℃作為分析的柱溫條件。

2.1.4 流速及進(jìn)樣量的選擇

流速大小會影響柱壓、洗脫時間和分離度，而進(jìn)樣量的大小則影響峰形。因本實驗室儀器為超高效液相色譜，考察0.25、0.35 mL·min-1的流速下的分離效果，綜合目標(biāo)峰其他條件，本實驗選擇流速為0.25 mL·min-1?？疾爝M(jìn)樣量為5.0、10.0和20.0 μL條件下的目標(biāo)峰峰形，5.0 μL條件下響應(yīng)值過低，峰形小；20.0 μL條件下時，因本次流動相為緩沖鹽溶液，為防止測定過程中鹽析出導(dǎo)致進(jìn)樣針堵塞，標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用超純水配制而不用流動相配制[4]。當(dāng)進(jìn)樣量過大時，色譜峰峰形會出現(xiàn)拖尾及峰展變寬現(xiàn)象，綜合考慮本實驗擇0.25 mL·min-1為最佳流速，10.0 μL進(jìn)樣量為最佳進(jìn)樣量。

2.2 線性關(guān)系及檢出限

將一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣分析，在質(zhì)量濃度為1.0～20 mg·L-1時，各組分均與其各自對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系（r＞0.995），在7 min內(nèi)全部目標(biāo)峰均可找到。以最低標(biāo)準(zhǔn)管混標(biāo)在儀器最靈敏的狀態(tài)下進(jìn)樣,記錄信噪比S/N，按3倍信噪比計算出各自的檢出限，各目標(biāo)峰的保留時間、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

表2 5種添加劑的保留時間、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限表

2.3 精密度試驗

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度3連續(xù)測定（n=11），試算峰面積的RSD分別為：山梨酸0.2%、苯甲酸0.1%、糖精鈉0.1%、安賽蜜0.5%、咖啡因0.1%。此項符合分析方法要求（＜2.0%）。

2.4 實際樣品測試

對市售的飲料進(jìn)行檢測，按照上述方法對樣品中的山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜和咖啡因進(jìn)行測定，樣品均達(dá)到衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)測的要求。

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜儀同時檢測飲料中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜和咖啡因5種添加劑，處理簡單，檢測速度快，重現(xiàn)性好，檢出限低，可以滿足GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》飲料中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜和咖啡因的限量要求，有較高的應(yīng)用價值。