王祎，于景華

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

0 引 言

母乳被稱為營養(yǎng)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，它可以促進嬰幼兒的生長發(fā)育并滿足健康所需。母乳中含有多種有益于人體健康的功能成分，其中人乳低聚糖（Human Milk Oligosaccharides，HMOs）的作用十分顯著[1]。各個國家的學(xué)者對HMOs的研究都有很長的歷史，對HMOs分離檢測方法的研究已有近90年[2]。人類的進化史，除了人類細胞和器官的進化，還有微生物菌群值得思考。每個人都可以視為由各種微生物定居的棲息地所組成的“島嶼”。這些數(shù)以億萬計的微生物主要存在于腸道中，形成了復(fù)雜的微生物群落，稱之為腸道菌群[3-4]。腸道菌群會參與影響人類健康的多種生理活動。本文主要闡述了HMOs對嬰兒腸道菌群的影響，希望對嬰幼兒配方奶粉的設(shè)計與發(fā)展有一定的實際應(yīng)用價值。

1 人乳低聚糖的結(jié)構(gòu)

HMOs的單體是D-葡萄糖（Glc），D-半乳糖（Gal），N-乙酰葡糖胺（GlcNAc），L-巖藻糖（Fuc）和唾液酸[N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc）]，其他哺乳動物的唾液酸中還包括N-羥乙酰神經(jīng)氨酸[5]。到目前為止，已有至少120種人乳低聚糖的結(jié)構(gòu)被確定，根據(jù)其核心結(jié)構(gòu)，可把HMOs分為13類。此外，根據(jù)編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因II型和III型，可將人乳分為四類：Se+/Le+，Se+/Le-，Se-/Le+，Se-/Le-[5]。

所有HMOs的還原末端都為乳糖，在酶的作用下，通過β-1,3或β-1,6糖苷鍵，連接N-乙酰葡糖胺殘基進行延伸。如果是以β-1,6鍵連接的，則HMOs可能為支鏈結(jié)構(gòu)。在此三糖的基礎(chǔ)上，其非還原末端通過β-1,3或β-1,4糖苷鍵連接半乳糖，則構(gòu)成了人乳低聚糖的核心結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)確定了超過15種的二糖結(jié)構(gòu)。巖藻糖殘基可以通過α-1,2、α-1,3或α-1,4鍵，唾液酸殘基通過α-2,3或α-2,6鍵連接到核心結(jié)構(gòu)，這構(gòu)成了HMOs的多樣性[6]。

2 人乳低聚糖與牛乳低聚糖的比較

不同時期HMOs的質(zhì)量濃度不同，人初乳低聚糖質(zhì)量濃度為22～24 g/L，成熟乳中低聚糖質(zhì)量濃度為10～15 g/L。作為比較，在母牛產(chǎn)后立即收集牛初乳，經(jīng)檢測其中低聚糖質(zhì)量濃度約1 g/L，在48 h后質(zhì)量濃度迅速降低[7]。人乳內(nèi)巖藻糖基化的低聚糖質(zhì)量濃度高，唾液酸化的低聚糖僅約為10%～15%。牛乳則相反，唾液酸化低聚糖高達70%[8]。在牛乳中，少量的唾液酸化低聚糖含有半乳糖苷乳糖，這種結(jié)構(gòu)在HMOs中是不存在的，中性低聚糖的數(shù)量要超過酸性低聚糖，目前已知的67種低聚糖中，有38種是中性的，29種是酸性的。巖藻糖基化低聚糖占HMOs的絕大部分。與此不同的是在牛乳中酸性低聚糖的含量要高于中性低聚糖，并且?guī)r藻糖基化低聚糖濃度很低。牛初乳中含有多聚N-乙酰乳糖胺（LacNAc），LacdiNAc和GalNAc(1-4)Glc，但是在人乳或人初乳中并未檢測出。人乳與牛乳低聚糖的差異性可對乳產(chǎn)品研發(fā)起指導(dǎo)作用。

3 嬰兒腸道菌群

嬰兒身體上的細菌主要有五大類群：放線菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門。根據(jù)嬰兒腸道菌群的組成和優(yōu)勢菌群的存在可將嬰兒腸道的核心菌群分為六組，第一組為鏈球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Faecalibacterium菌屬；第二組為梭菌屬、毛螺旋菌科、Blautia菌屬；第三組為巴斯德氏目；第四組為艾?！ぶ举R菌屬；第五組為韋榮球菌屬；第六組為擬桿菌屬[9]。嬰兒的腸道菌群在從分娩到產(chǎn)后的過程中會有一定變化：變形菌門和放線菌門的兩類細菌在減少，厚壁菌門和擬桿菌門的兩類細菌有所增加[10]。

3.1 嬰兒腸道菌群的來源及影響因素

微生物會在新生兒出生后迅速在腸道中定殖，人乳驅(qū)動并調(diào)節(jié)菌群的結(jié)構(gòu)和功能[10]。之前的研究表明，新生兒在分娩過程中能夠獲得母親陰道中的微生物，如乳桿菌屬。剖腹產(chǎn)嬰兒的口腔、皮膚和腸道多為葡萄球菌，鏈球菌或丙酸桿菌[11]。然而近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在胎兒早期，細菌可能通過兩種路徑進行定殖：血行性路徑和上行性路徑[10,12]。研究者推測血液流動可能將母體口腔內(nèi)細菌傳遞給胎兒。胎兒所生活的子宮環(huán)境并非無菌，接近25%的早產(chǎn)兒是由于母親宮內(nèi)感染和隱匿性微生物侵入羊膜腔造成的。在子宮內(nèi)檢測到的細菌是常見的陰道寄生菌，這表明至少在早產(chǎn)時，子宮微生物群來自陰道感染。對于足月分娩的健康母親來說，胎盤[13]、臍帶[14]、羊水[15]中存在細菌。這些細菌通過體內(nèi)的遞送方式定殖于胎兒腸道，這也是影響腸道菌群早期組成的重要因素。母親生產(chǎn)后的喂養(yǎng)方式（母乳或奶粉），母親的飲食，社會經(jīng)濟地位，吸煙情況，抗生素的使用以及對微生物和早期免疫調(diào)節(jié)有深遠影響的其他環(huán)境因素，都會影響嬰兒的腸道菌群[16]。

3.2 人乳低聚糖對腸道菌群的影響

HMOs是一種益生元，可作為嬰兒腸道中有益菌的代謝底物，有益菌包括雙歧桿菌等（如Bifidobacterium bifidumJCM 1254,Bifidobacterium longum subsp.infantisJCM 1222,Bifidobacterium longum subsp.longumJCM 1217）[17]，可以幫助嬰兒塑造腸道菌群。HMOs可作為抑菌劑或者殺菌劑，還可抗病毒感染。HMOs不僅比現(xiàn)有的藥物安全，而且具有更廣泛的抗病毒保護機制，系統(tǒng)地發(fā)揮抗病毒活性。當(dāng)HMOs作為人類的抗病毒藥物時，可以刺激上皮細胞的免疫反應(yīng)和成熟[18]。當(dāng)HMOs作為直接抗病毒藥物時，可以作為病毒的可溶性受體，通過模擬病毒受體的結(jié)構(gòu)，阻斷對靶細胞的粘附，防止感染[19-20]。如今，HMOs的抗粘附性已成為研究熱點。Gordon團隊對兩組產(chǎn)后六個月產(chǎn)婦的HMOs進行分析，發(fā)現(xiàn)患有嚴重發(fā)育遲緩嬰兒的母乳中唾液酸化低聚糖缺乏。為了進一步研究其聯(lián)系性，研究人員以當(dāng)?shù)厥澄镂桂B(yǎng)小鼠作為對照組，食物中添加牛乳低聚糖為實驗組。在喂養(yǎng)接種了不成熟微生物菌群的小鼠后，發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)育明顯正常，除了肌肉量、骨質(zhì)密度指標(biāo)轉(zhuǎn)好之外，小鼠大腦發(fā)育、肝臟代謝都得到了積極改善。同時此團隊使用豬作為測試對象，并得到同樣結(jié)果。因此推測HMOs可對腸道菌群進行調(diào)節(jié)[21]。

很少有關(guān)于腸道菌群與HMOs體內(nèi)消耗之間聯(lián)系的研究。De Leoz團隊以兩名健康母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便為樣本，通過DNA測序確定了細菌種類，并通過質(zhì)譜確定了未被腸道細菌消耗的特定HMOs的豐富度。他們發(fā)現(xiàn)在嬰兒出生的幾周內(nèi)，腸道菌群從非消耗HMOs逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橄腍MOs的菌群。在這個過程中腸桿菌科和葡萄球菌科在減少，類桿菌科與雙歧桿菌科的比例在增加[22]。Mei Wang團隊研究了HMOs與腸道菌群之間的聯(lián)系性，喂養(yǎng)母乳與喂養(yǎng)嬰幼兒配方食品的嬰兒腸道菌群組成不同，后者擬桿菌比例較高，梭菌屬XVIII、毛螺菌屬、鏈球菌、腸球菌等比例較低。兩種喂養(yǎng)方式的嬰兒腸道菌群都以雙歧桿菌為主。人乳中最豐富的HMOs為乳糖-N-四糖+乳糖-N-新四糖（22.6%）其次是2'-巖藻糖基化乳糖（14.5%）和乳糖-N-巖藻五糖I（9.5%）[23]。

3.2.1 壞死性小腸結(jié)腸炎

盡管在新生兒護理方面取得了很大的進步，但是壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）仍然是最常見且死亡率很高的腸道疾病之一[24]。超過四分之一的受感染嬰兒死于NEC，幸存的嬰兒常常面臨長期的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[25]。與母乳喂養(yǎng)的嬰兒對比，喂養(yǎng)嬰幼兒配方食品的嬰兒患NEC的風(fēng)險高達6-10倍[26]。體外研究表明，HMOs可能調(diào)節(jié)嬰兒免疫系統(tǒng)并減少腸粘膜中性粒細胞的滲透和活化。細菌的定殖和過度的中性粒細胞活性，是NEC發(fā)病機制的關(guān)鍵特征之一[27-28]。

2012年Jantscher-Krenn團隊鑒定出一種特殊的HMOs：二唾液酸化乳-N-四糖（DSLNT），它能有效的預(yù)防新生大鼠患NEC。實驗還發(fā)現(xiàn)與DSLNT結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，缺少一個或兩個唾液酸殘基的唾液酸乳糖-N-四糖(LSTb)和乳糖-N-四糖（LNT），沒有相同的效果，這表明DSLNT具有高度的結(jié)構(gòu)特異性[29]。然而大鼠實驗具有明顯的局限性，因為它不能完全代表臨床結(jié)果，所以在進行臨床實驗前，必須仔細考慮由動物模型所得出的結(jié)果。為了彌補大鼠實驗和臨床研究之間的差距，Autran團隊進行了獨立的母嬰分組分析，他們發(fā)現(xiàn)，NEC患兒的母乳中，有一種特定的HMOs：DSLNT水平低于對照組。人乳DSLNT水平可能是鑒定NEC高?；純旱挠行飿?biāo)志物，補充DSLNT有望成為有效的預(yù)防方法[30]。DSNLT可以作為天然模板用于開發(fā)預(yù)防NEC的新型藥劑。并且Autran團隊也證明了Jantscher-Krenn團隊小鼠實驗的結(jié)論[31]。然而，驗證DSLNT降低NEC風(fēng)險還需要大量的臨床研究。

之前的研究表明，脂多糖感受器Toll樣受體(TLR 4)在NEC疾病發(fā)展中具有重要作用。Yazji團隊推測內(nèi)皮細胞中的TLR 4信號通過血管舒張分子內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)調(diào)節(jié)腸道吸收而對NEC起作用。團隊從小鼠內(nèi)皮細胞選擇性地刪除TLR 4，結(jié)果顯示TLR 4的活性是NEC病情發(fā)展的關(guān)鍵之一[32]。HMOs中富含2'-巖藻糖基化乳糖（2'-FL）。Good團隊推測，2'-FL可以通過增強腸粘膜血流量來保護嬰兒預(yù)防NEC。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，TLR 4激活可以減少eNOS的mRNA在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)內(nèi)的表達，但2'FL添加可以恢復(fù)eNOS的表達。Good團隊證明，2'-FL通過增加eNOS恢復(fù)腸道吸收，保護小腸黏膜結(jié)構(gòu)。添加2'-FL的嬰幼兒配方食品可以通過eNOS調(diào)節(jié)新生兒腸道黏膜的血流量，用以防護NEC[33]。

3.2.2 B族鏈球菌

B族鏈球菌（GBS，又名無乳鏈球菌）是一種革蘭氏陽性細菌性病原體，其感染是引發(fā)嬰兒發(fā)病與死亡的主要原因[34]。在懷孕期間，GBS是胎膜感染（絨毛膜羊膜炎）的一個重要原因，可導(dǎo)致羊膜腔感染、早產(chǎn)、死胎、新生兒敗血癥。HMOs可選擇性刺激腸道中有益菌群（雙歧桿菌和乳桿菌）的增殖，間接抑制有害菌群生長，維持腸道微生態(tài)平衡[35]。

Andreas團隊通過咽和直腸拭子進行實驗樣本收集。探究HMOs對出生0～90天嬰兒GBS定殖的關(guān)系。證明了在含有乳糖-N-二巖藻黃素六糖或其它有相似分支結(jié)構(gòu)HMOs的體內(nèi)條件下，可以阻止GBS的增殖[34]。并且乳糖-N-二巖藻黃素六糖還可以促進腸道產(chǎn)生有益細菌，防止新生兒感染GBS。HMOs的組成受Lewis抗原系統(tǒng)影響，實驗表明Lewis血型陽性母親的嬰兒被GBS定殖的幾率更低。所以乳糖-N-二巖藻黃素六糖可以用作GBS治療的輔助手段。其他研究人員表示，在體外條件下GBS不能在含有某種特定HMOs的培養(yǎng)環(huán)境下增殖。某些非唾液酸化人乳低聚糖有抑制GBS增殖的作用。進一步的體外研究表明，GBS通過糖基轉(zhuǎn)移酶將HMOs結(jié)合到細胞膜上，阻止細菌增殖。這種機制與抗生素類似[36]。Ackerman團隊的最新研究，在GBS細胞培養(yǎng)液中添加HMOs，以觀察它對GBS生長和生物膜形成的影響。結(jié)果顯示，GBS的生長受到HMOs不同程度的抑制。其中抑制程度較弱一組的細菌生長曲線表明，在培養(yǎng)液中加入HMOs的最初8 h內(nèi)，細菌的生長明顯減緩，且在最初4-6小時內(nèi)，HMOs對細菌生長的抑制百分比接近23%，并在第7小時時降至14.4%。并且HMOs可明顯降低細菌生物膜/生物質(zhì)的比率[37]。HMOs會對GBS的生物膜產(chǎn)生影響，從而起到阻止GBS的作用。HMOs中的乳糖-N-二巖藻黃素六糖可用作治療GBS的輔助手段。

Lin團隊發(fā)現(xiàn)HMOs具有新的性質(zhì)，可直接抑制GBS而不依靠宿主的免疫。通過多維色譜法分離HMOs的不同組分，發(fā)現(xiàn)僅有特定的非唾液酸化人乳低聚糖具有抑菌性，并且可與多種常規(guī)抗生素協(xié)同作用。GBS轉(zhuǎn)座子插入文庫的表型篩選確定了GBS的一種編碼假定糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性基因，這種基因賦予了對HMOs的抗性，表明HMOs可以作為替代底物，損壞鏈球菌的生長動力學(xué)，從而破壞GBS組成。此研究揭示了HMOs的一種獨特抗菌作用[38]。

3.2.3 雙歧桿菌

在研究的眾多微生物中，雙歧桿菌可以綜合利用HMOs。母乳中低聚糖可以增強嬰兒腸道中雙歧桿菌的優(yōu)勢作用。Garrido團隊從嬰兒腸道中篩選了長雙歧桿菌亞種與兩歧雙歧桿菌。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較了兩種菌代表性植株的全部轉(zhuǎn)錄組。團隊發(fā)現(xiàn)雖然雙歧桿菌都可以將HMOs用做唯一碳源，但是利用的模式不同。嬰兒雙歧桿菌對特定HMOs底物的利用能力基本相同，而兩歧雙歧桿菌更具多樣化。根據(jù)兩歧雙歧桿菌SC555和嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697的轉(zhuǎn)錄組顯示，兩種菌株共同利用的HMOs結(jié)構(gòu)與中性HMOs相似，但后者的一些菌株不能在巖藻糖基化或唾液酸化的HMOs上生長[39]。

Asakuma團隊研究表明，在HMOs為碳源的條件下，B.longum subsp.infantisJCM 1222增殖快，且在10小時內(nèi)，細胞密度達最大值。B.bifidumJCM 1254在前期顯示出增殖，但在15小時后進入靜止期。相反B.longum subsp.longumJCM 1217和B.breveJCM 1192并沒有明顯增殖[40]。Garrido團隊研究證明，嬰兒腸道菌群通常定殖了兩種長雙歧桿菌的兩個亞種：B.infantis和B.longum。所有B.longum菌株均可有效利用乳糖-N-四糖，某些菌株可利用巖藻糖基化人乳低聚糖。其中B.longumSC596能夠在HMOs條件下很好地生長，因為含有一種新的基因簇，所以可以優(yōu)先利用巖藻糖基化人乳低聚糖[41]。

嬰兒雙歧桿菌可以降低腸黏膜道通透性。在小鼠中定殖人類排泄物中的微生物，可發(fā)現(xiàn)增加雙歧桿菌的數(shù)量可減少細菌易位的現(xiàn)象。HMOs激活嬰兒雙歧桿菌中的多種基因，使其能夠在腸道菌群中占據(jù)主導(dǎo)位置，通過加速免疫反應(yīng)的成熟，抑制炎癥，改善腸道通透性和增加乙酸鹽的產(chǎn)生，從而有利于嬰兒的健康。還有大量研究證明，許多雙歧桿菌編碼細胞表面的胞外多糖（EPS），細胞表面長有稱作菌毛的蛋白質(zhì)附屬物，或者在細胞表面會分泌一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，所有這些都可能在腸道中產(chǎn)生作用[12]。

3.2.4 腹瀉

HMOs中富含大量2'-FL，它可以抑制空腸彎曲桿菌和杯狀病毒增殖以及阻止大腸桿菌所產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性腸毒素與宿主細胞配體結(jié)合。之前的研究表明2'-FL可降低大腸桿菌毒素導(dǎo)致的感染。Morrow團隊選擇93名剛出生且接受母乳喂養(yǎng)的嬰兒作為實驗對象，跟蹤調(diào)查兩年。每周收集嬰兒的喂養(yǎng)情況與腹瀉數(shù)據(jù)并且分析產(chǎn)后1-5周母乳樣本中低聚糖含量。結(jié)果可知，母乳中2'-FL含量高時，中度至重度腹瀉的發(fā)生率較低。2'-FL可以降低彎曲桿菌和杯狀病毒所引起的腹瀉率以及嬰兒腹瀉發(fā)病率[42]。

諾如病毒，又稱諾瓦克病毒，是急性胃腸炎的主要病原體之一。根據(jù)VP1衣殼基因的不同可將其分為六個基因組GI-GVI，其中GI和GII是導(dǎo)致人類感染的主要基因組。諾如病毒感染的關(guān)鍵是其與組織血型抗原(HBGAs)之間的相互作用[43]。HBGAs主要分布在腸道、呼吸道上皮細胞，在人類分泌物中也有發(fā)現(xiàn)。實驗發(fā)現(xiàn)諾如病毒還會與HMOs相互作用，HMOs具有與構(gòu)成HBGAs結(jié)構(gòu)相似的單糖組成，可以模擬HBGs，作為一種受體誘餌，與病毒結(jié)合[22]。Koromyslova團隊研究發(fā)現(xiàn)HMOs不僅可以模擬HBGAs與GII.10諾如病毒結(jié)合，還可以與其他基因組的諾如病毒結(jié)合。團隊通過X射線晶體學(xué)確定了GII.17變體的HBGA結(jié)合口袋，并且實驗發(fā)現(xiàn)GII.17諾如病毒與GII.4具有相同對的P區(qū)結(jié)構(gòu)殘基。HMOs中2'-FL可阻止GI.1和GII.17病毒粒子病毒與HBGAs結(jié)合[44]。還需要對3'-巖藻糖基化乳糖與3'-巖藻糖基化低聚糖進一步研究，因為通過X射線晶體學(xué)和串聯(lián)質(zhì)譜研究發(fā)現(xiàn)它們會識別HBGA的結(jié)合位點并與之結(jié)合[45]。鑒于HMOs對諾如病毒的抵抗作用，可將其添加到嬰幼兒配方食品中模擬人乳。

輪狀病毒是呼腸弧病毒科的無包膜雙鏈核糖核酸病毒。病毒粒子最外層的結(jié)構(gòu)蛋白是VP4和VP7，前者是糖蛋白，主要參與病毒粒子組裝，后者形成病毒表面的突出，負責(zé)病毒的附著與侵入宿主細胞[46]。輪狀病毒感染是嬰兒腸胃炎和腹瀉的主要原因，占五歲以下嬰兒死亡總數(shù)的5%。

Hester團隊發(fā)現(xiàn)唾液酸化低聚糖能后在體外抑制輪狀病毒對宿主細胞的侵染，并且在小豬模型中發(fā)現(xiàn)中性和酸性HMOs能夠減少輪狀病毒的復(fù)制[47]。Li團隊的實驗表明，HMOs可以抑制輪狀病毒的結(jié)合或者復(fù)制，增強黏膜上Th1/Th2細胞因子應(yīng)答和組成調(diào)節(jié)，從而提高腸道代謝潛能。相反，益生元scGOS/lcFOS混合物僅促進機體對感染的全身性抗體應(yīng)答。因此添加HMOs的嬰幼兒配方食品可以用來防止輪狀病毒感染[48]。

4 結(jié) 論

嬰幼兒時期是身體和智力發(fā)育的關(guān)鍵期。母乳能滿足嬰兒的營養(yǎng)需求，作為嬰兒最安全、最天然的食物，含有嬰幼兒配方奶粉所沒有的免疫蛋白和生長因子。由于嬰幼兒配方奶粉的目的是模擬母乳，因此其中所添加各種成分的種類與含量應(yīng)以母乳為標(biāo)準(zhǔn)。

HMOs可以促進雙歧桿菌的增殖，并且可以與B族鏈球菌細胞膜結(jié)合從而抑制其生長甚至間接破壞細菌的形成。HMOs中的2'-FL會增加eNOS表達，恢復(fù)腸道吸收，保護小腸黏膜結(jié)構(gòu)，預(yù)防NEC。HMOs還可以抑制病毒感染，降低腹瀉率，促進免疫發(fā)育。添加有HMOs嬰幼兒配方奶粉的研發(fā)與普及已經(jīng)成為奶粉研究設(shè)計的大趨勢。