謝瑞龍，段國霞，莫楠，李翠枝，劉麗君，張立佳，胡雪

(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特010110)

0 引 言

喹諾酮類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，已經(jīng)被廣泛的用于動物的疾病治療與預(yù)防中[1]。這些藥物如果不正確的使用會導(dǎo)致在動物源性食品中的殘留，從而影響到人類的健康[2]。因此，世界多個國家規(guī)定了其在動物源食品中的最大殘留限量[3-4]。我國農(nóng)業(yè)部235公告中也規(guī)定相關(guān)喹諾酮在乳中的最大殘留限量[5]：例如達(dá)氟沙星不得超過30μg/kg，氟甲喹不得超過50μg/kg以及恩諾沙星與環(huán)丙沙星兩者之和的最大殘留限量為100μg/kg。

目前，喹諾酮類藥物的檢測方法[6-9]主要有高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、膠體金快速檢測法等。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有簡單、高效、靈敏度高等特點(diǎn)，是研究喹諾酮類藥物殘留常用的檢測方法。此外，新的前處理方法[10-12]能減少較為繁瑣的前處理步驟，使整個前處理更加簡單、高效。例如不少科研工作者利用新穎的固相萃取柱Oasis Prime HLB[11-12]，可以減少活化、平衡、洗脫等步驟，實(shí)現(xiàn)了牛奶、肉類等動物源食品中獸物殘留的快速檢測，這為本研究開展檢測奶粉中喹諾酮類藥物檢測提供了思路。然而在采用Oasis Prime HLB進(jìn)行快速前處理過程中，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由于受到奶粉高脂肪含量的影響，提取液提取時容易出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象或離心后有明顯的油脂層。因此，現(xiàn)有的前處理方法無法應(yīng)用到高脂肪奶粉基質(zhì)中，需要進(jìn)行優(yōu)化。本工作擬利用新穎的固相萃取柱Oasis Prime HLB，建立一種適用于不同脂肪含量奶粉，同時測定17種喹諾酮類藥物的簡單快速超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法。這為喹諾酮在奶粉中的檢測提供一種選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同脂肪含量的奶粉：高脂肪奶粉（脂肪含量為27.9%），中等脂肪奶粉（脂肪含量為13.5%），低脂肪奶粉（脂肪含量為1.2%）。

17種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于97%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈（色譜純），德國Merck公司；甲醇（色譜純），德國Merck公司；甲酸（色譜純），美國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫高速離心機(jī)，德國SIGMA公司；超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源），Oasis Prime HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），美國Waters公司；振蕩儀，Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

稱取0.30 g奶粉樣品于30 mL聚四氟乙烯離心管中，加入1 mL超純水混勻。加入8.0 mL 0.1%甲酸甲醇-乙腈（體積比1∶7）充分振蕩混勻后，繼續(xù)渦旋振蕩10 min。10 000 r/min離心5 min，將一半上清液直接轉(zhuǎn)移至Oasis Prime HLB固相萃取柱（無需活化和平衡）中，收集全部流出液，40℃氮?dú)獯蹈伞? mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（體積比90∶10）復(fù)溶，漩渦震蕩，過0.20μm濾膜，供上機(jī)分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱，100 mm×2.1 mm(i.d.)，1.7μm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.45 mL/min；線性梯度洗脫條件：0～1.0 min，90%A；1.0～6.0 min，90%～50%A；6.0～8.0 min，50%～5%A；8.0～10.0 min，5%A；10.0～12.0 min 90%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓：3.17 k V；源溫：150℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/Hr；碰撞室氣流量：0.17 mL/min。多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）檢測。

1.4 結(jié)果計(jì)算

所有化合物均采用外標(biāo)法定量。每種喹諾酮類藥物殘留量按式（1）計(jì)算：

該方程式式中，Xi為試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；ci為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V為樣品溶液定容體積，單位為毫升（mL）；m為樣品溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法選擇

參考Oasis Prime HLB快速前處理牛奶基質(zhì)的方法[11]，進(jìn)行奶粉中喹諾酮類藥物殘留的檢測。當(dāng)進(jìn)行一些脂肪含量高的嬰兒配方奶粉前處理試驗(yàn)時，發(fā)現(xiàn)其前處理?xiàng)l件不滿足要求：用0.2%甲酸乙腈提取過程中，提取物成黏稠狀，并伴隨有結(jié)塊現(xiàn)象，提取效果不理想；離心后上清液底部會出現(xiàn)明顯的油脂層現(xiàn)象，油脂層會造成固相萃取柱堵塞，若加壓容易導(dǎo)致油脂與有機(jī)溶液共流出。為了排除是產(chǎn)品特例現(xiàn)象，本研究對不同品牌的高脂肪含量的奶粉以4 mL 0.2%甲酸乙腈作為提取液進(jìn)行了前處理，均存在上述現(xiàn)象（如表1）。因此本研究對其前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到能同時滿足不同脂肪含量奶粉的要求。

表1 4種不同嬰兒配方奶粉的前處理試驗(yàn)現(xiàn)象

本方法對提取液體積和提取液組分進(jìn)行優(yōu)化：經(jīng)過多組試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取液體積由4 mL增加至8 mL時，離心后，上清液底物的油脂層消失，有利于過固相萃取柱。選取混合組分時，在乙腈溶劑提取液中，增加甲醇溶劑的量和減少甲酸含量，可以避免奶粉振蕩過程中的結(jié)塊現(xiàn)象。在解決完提取過程和離心過程遇到的問題后，本實(shí)驗(yàn)考查了不同混合提取液對喹諾酮類藥物提取效率的影響，包括甲醇-乙腈（體積比1∶7，提取液1）、甲醇-乙腈（體積比2：6，提取液2）、0.1%甲酸甲醇-乙腈（體積比1∶7，提取液3）、0.1%甲酸甲醇-乙腈（體積比2∶6，提取液4）。回收率數(shù)據(jù)結(jié)果，如圖1顯示，提取液1和2的回收率范圍分別為51.6%～84.2%和44.2%～81.7%，回收率值偏低，提取液3和4的回收率范圍分別為回收率79.9～94.3%和68.1～89.5%，回收率明顯優(yōu)于提取液1和2，說明在含有甲酸的提取液有利于提取效果。此外，采用提取液3方案時，回收率整體優(yōu)于提取液4。因此，最終選取0.1%甲酸甲醇-乙腈（體積比1∶7）作為提取液。

圖1 不同提取液對17種喹諾酮回收率的影響

2.2 上機(jī)條件選擇

對已報(bào)道的文獻(xiàn)調(diào)研，目前報(bào)道的喹諾酮類藥物殘留檢測方法[11-15]已對色譜柱以及流動相的選擇進(jìn)行了優(yōu)化，因此本研究參考文獻(xiàn)的條件[11,15]，色譜柱選用Waters BEH C18，流動相選擇乙腈-0.1%甲酸溶液，采用梯度洗脫的方式，能有效地分離17種目標(biāo)化合物。此外，系列化合物的保留時間、定量離子對、定性離子對、錐孔電壓以及碰撞電壓見表2。

表2 17種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜條件

2.3 基質(zhì)效應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線

本試驗(yàn)考察了不同脂肪含量的奶粉基質(zhì)效應(yīng)。用每種空白基質(zhì)加復(fù)溶液配制5μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液與用前處理復(fù)溶液配制的5μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行比較，求兩者峰面積的比值，大于100%為基質(zhì)增強(qiáng)作用，反之則為基質(zhì)抑制作用。每組樣品重復(fù)條件下做5次，取平均值[17]?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果顯示，高脂肪含量（27.9%）的奶粉基質(zhì)效應(yīng)為62.5%～99.4%，中等脂肪含量（13.5%）的奶粉基質(zhì)效應(yīng)為57.4%～130.2%，低脂肪含量（1.2%）的奶粉基質(zhì)效應(yīng)為61.7%～113.4%。其中3種不同脂肪含量奶粉對培氟沙星化合物表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制的作用，分別是62.5%，57.4%和61.7%；中等脂肪含量和低脂肪含量的奶粉對達(dá)氟沙星有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，分別是130.2%和113.4%；3種奶粉樣品對于其他化合物有不同程度的基質(zhì)抑制作用。因此，本研究采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

17種喹諾酮類獸藥的準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系如表3所示。由表3可以看出，17種物質(zhì)的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9900，其中低脂肪含量奶粉樣品的相關(guān)系數(shù)均大于0.9950。在奶粉中17種喹諾酮類化合物的定量限為3.0μg/kg，其信噪比（S/N）均滿足≥10的要求。

2.4 回收率與精密度試驗(yàn)

本研究選擇具有代表性的，3種不同脂肪含量的基質(zhì)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)：每個添加水平均進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，依次測定3μg/kg（定量限）、30μg/kg以及60 μg/kg 3個不同濃度的加標(biāo)回收率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)試驗(yàn)數(shù)據(jù)

由表3可知，在高脂肪奶粉樣品中，17種喹諾酮類藥物的加標(biāo)回收率為70.0%～99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～8.9%；在中等脂肪奶粉樣品中，17種喹諾酮類藥物的加標(biāo)回收率為65.3%～104.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～8.0%；在低脂肪奶粉樣品中，17種喹諾酮類藥物的加標(biāo)回收率為66.7%～100%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～6.7%。所有結(jié)果說明該方法適用于不同脂肪含量的奶粉中不同濃度的喹諾酮類藥物殘留的測定，均表現(xiàn)出較好的回收率和精密度。

3 結(jié)論

本文提供了一種適用于不同脂肪含量奶粉基質(zhì)中17種喹諾酮類藥物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法。本研究采用了Oasis Prime HLB固相萃取柱，能簡化前處理過程；重點(diǎn)對試驗(yàn)前處理進(jìn)行了研究，選取0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶劑提取時，效果最優(yōu)；同時考查了不同脂肪含量樣品的基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)空白配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保證該方法的可靠性。喹諾酮類藥物的定量限為3.0μg/kg。當(dāng)其添加范圍為3.0～60μg/kg時，其準(zhǔn)確度和精密度均符合國標(biāo)要求?？傮w而言，該方法具有簡單方便、快速高效的特點(diǎn)，適用于不同脂肪含量奶粉產(chǎn)品的檢測。