李江，黎丁滔，綦艷，嚴(yán)家俊，邱啟東，佘之蘊(yùn)

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東佛山528300）

0 引 言

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，從其化學(xué)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生衍生物的不同并經(jīng)鑒定的約20種，其中AFB1、B2、G1、G2、M 1、M 2等危害性較大[1-2]。黃曲霉毒素 B1(AFB1)，分子量：312.3，分子式：C17H12O6，與致癌有關(guān)[3-4]。黃曲霉毒素M 1(AFM 1)是黃曲霉毒素B1(AFB1)的羥基化代謝產(chǎn)物，其外觀為白色或微黃色粉末，分子式為C17H12O7,分子量為328.3[5-6]，該毒素由Alleroft首先在牛奶中發(fā)現(xiàn)[7-8]，并命名為黃曲霉毒素M(Aflatoxin M)，主要有M 1和 M 2兩種，有致癌性[9-11]。由于AFB1，AFM 1都具有強(qiáng)致癌性，建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有重要意義，現(xiàn)對(duì)AFBI、AFM 1的檢測(cè)方法有薄層色譜法TLC（Thin Layer Chromatograph）[12-14]、高效液相色譜法HPLC(High Performance Liquid Chromatography)[15-20]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法HPLC-MS/MS(High performance liquid chromatography mass spectrometry/massspectrometry)[21-22]、ELISA（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）法等[23-25]，薄層色譜法只能定性且操作步驟繁瑣；高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法前處理復(fù)雜，檢測(cè)成本高，需要大型檢測(cè)設(shè)備；而ELISA法、操作步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)成本較低，適合不同樣本快速篩選及檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)、分析化學(xué)等領(lǐng)域[26-28]，新頒布實(shí)施的GB5009.22-2016食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定和GB 5009.24-2016食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定[29-30]，也將此法列入其中。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇，批號(hào)：20161028，天津大茂化學(xué)試劑廠提供；純水。

1.2 儀器與材料

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀（Thermo），離心機(jī)（Sigma），電子天平(TIANFU)。

檢測(cè)樣品為牛奶，盒裝液體，市售，產(chǎn)品批號(hào)：20180517；AFB1、AFM 1標(biāo) 準(zhǔn) 品（sigma），批 號(hào) ：20161206；AFB1、AFM 1質(zhì)控品（中國(guó)檢科院），批號(hào)：20161122；AFB1、AFM 1 ELISA試劑盒，（江蘇美正生物技術(shù)有限公司）批號(hào)：20170927。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.0±0.2 g樣本到三角瓶中，加入25.0 mL，60%的甲醇-水，樣品稀釋5倍，渦旋混勻放在振蕩器上振搖15.0 min，將混合液放入50.0 mL離心管中，6 000 r/min離心2.0 min，用濾紙過(guò)濾；取1 mL濾液到5.0 mL試管，加入4mL純水稀釋，總稀釋倍數(shù)25倍，待測(cè)。

1.3.2 樣本中AFB1、AFM 1的檢測(cè)

將試劑盒從冰箱取出，在室溫環(huán)境平衡60 min，按照試劑盒操作說(shuō)明書，依次加入100μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品和樣本到微孔中，再加入50μL/孔AFB1酶標(biāo)物、抗試劑，混勻，避光，于室溫環(huán)境孵育15min；孵育結(jié)束，倒掉微孔中的反應(yīng)液，用250μL/孔洗滌液洗3～5次，接著在紙巾上拍打，去除洗滌液；加入100μL/孔顯色液，混勻，避光，于室溫孵育5～7 min；孵育結(jié)束，加入100μL/孔終止液，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。（AFM 1的樣本檢測(cè)和具體操作步驟同AFB1）

1.4 結(jié)果分析

用分析軟件（Rida soft）對(duì)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1回收率結(jié)果

按試劑盒操作說(shuō)明，取陰性質(zhì)控品，分別添加0.2 μg/kg，0.4μg/kg和0.8μg/kg三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 AFB1回收率結(jié)果

從表1測(cè)定結(jié)果中可知：當(dāng)加標(biāo)濃度為0.2μg/kg時(shí)，回收率為105.0%；加標(biāo)濃度為0.4μg/kg時(shí)，回收率為110.0%；加標(biāo)濃度為0.8μg/kg時(shí)，回收率為103.8%；回收率結(jié)果均在50%～120%范圍，符合國(guó)標(biāo)對(duì)回收率的要求。

2.2 AFM 1回收率結(jié)果

按試劑盒操作說(shuō)明，取陰性質(zhì)控品，分別添加0.2μg/kg，0.4μg/kg和0.8μg/kg三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

從表2測(cè)定結(jié)果可知：當(dāng)加標(biāo)濃度為0.2μg/kg時(shí)，陰性樣品的回收率為100.5%；加標(biāo)濃度為0.4μg/kg時(shí)，陰性樣品回收率為99.2%；加標(biāo)濃度為0.8μg/kg時(shí)，陰性樣品的回收率為101.5%；3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度回收率均在50%～120%范圍，符合國(guó)標(biāo)中對(duì)回收率的要求。

2.3 方法檢出限

表2 AFM1回收率測(cè)定結(jié)果

對(duì)10份陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算AFB1、AFM 1的含量，方法的檢出限等于陰性空白樣本的檢測(cè)平均值加上陰性樣本檢測(cè)濃度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3 AFM1方法檢出限結(jié)果（n=10）

3 結(jié)論

建立了一種快速檢測(cè)乳制品中AFB1、AFM 1的方法，AFB1的回收率分別為：98.7%、97.3%及103.6%；AFM 1的回收率為：100.5%、99.2%及101.5%；方法檢出限為0.03μg/kg。檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且靈敏度高，適用于對(duì)乳制品中AFB1、AFM 1的快速檢測(cè)。