季宏更 鄭惠華 全衛(wèi)豐* 蔣 益 劉廣建 薛 璟 汪 潔

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇省（蘇微）菌物工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫214063；3江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通216009）

灰樹花屬于擔子菌亞門，層菌綱，無隔擔子菌亞綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花屬中的一種大型真菌[1]，又名貝葉多孔菌，舞茸?；覙浠ǘ嗵鞘腔覙浠ǖ闹饕δ苄猿煞种?，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用[2]，有著重要的市場開發(fā)價值。Ohno等采取液體深層培養(yǎng)的方法生產(chǎn)灰樹花多糖，并對其進行分離及成分研究，證明其與天然來源的灰樹花多糖具有相似的單糖組成和結(jié)構(gòu)[3，4]，灰樹花多糖根據(jù)來源的不同又可分為胞內(nèi)多糖和胞外多糖，二者均具有類似的生物活性，國內(nèi)外的研究實踐表明液體發(fā)酵法生產(chǎn)提取制備灰樹花多糖是實現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑和方法。目前真菌多糖的提取方法有水提醇沉法、酸堿提取法等，水提醇沉法具有對環(huán)境友好、提取工藝簡單等優(yōu)點，是目前應用較多的方法，但其提取效率有待于進一步提高。近年來也出現(xiàn)了利用超聲輔助、微波輔助、蒸汽爆破法以及酶法等進行真菌多糖的輔助提取，取得了一定的效果，均是通過一定的方法破壞細胞和細胞壁，促進目標物的溶出。超聲提取利用超聲產(chǎn)生的“空穴作用”破壞細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)，增加了細胞內(nèi)溶物的穿透能力；微波提取法是通過微波傳遞能量到細胞，使細胞內(nèi)壓力增大，細胞壁破裂從而形成微孔，加速細胞內(nèi)容物的溶出；而蒸汽爆破法是利用蒸汽受壓縮而后突然減壓時釋放出的強大力量沖破物料細胞壁，撕裂組織，從而提高物質(zhì)的提取效率。筆者對灰樹花液體發(fā)酵工藝進行了研究和優(yōu)化，旨在提高灰樹花多糖的產(chǎn)率；同時綜合比較了多種不同的輔助提取方法對于灰樹花多糖提取的效果，以期在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上優(yōu)選出一種更為理想的多糖提取工藝，提升灰樹花粗多糖的提取效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

①供試菌株：灰樹花菌株，編號AHSWF-001，為自有誘變菌株。②儀器與設(shè)備：旋轉(zhuǎn)式搖床（HZ-81），100 L發(fā)酵罐及配套裝備，循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA，紫外可見分光光度計（Alpha-1500），SG2pH計（梅特勒托利多），超聲波清洗儀K45200DE，微波儀（KJ25B-A），高壓蒸汽爆破儀（自制）。③培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基為葡萄糖2%，馬鈴薯（去皮煮沸過濾取汁）2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂2%，水1000 mL，pH自然。種子液培養(yǎng)基為豆餅粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，加水1000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰樹花液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.1.1 單因素試驗

試驗確定適宜的碳源和氮源。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，加水1000 mL，pH自然。

碳源的優(yōu)選：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2%質(zhì)量比的供試碳源（蔗糖、玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉），考察添加不同的碳源對灰樹花液體發(fā)酵菌絲生物產(chǎn)量的影響；

氮源的優(yōu)選：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%質(zhì)量的供試氮源（豆餅粉，麩皮，蛋白胨，酵母膏，尿素）（豆餅粉、玉米粉過80目篩，99℃浸提1 h，麩皮99℃浸提1 h），考察添加不同的氮源對灰樹花液體發(fā)酵菌絲生物產(chǎn)量的影響。

上述試驗每個處理作三個平行。液體種制作：PDA斜面菌種活化后，接種于種子液中，140 r/min，26℃培養(yǎng)10 d（下同）。發(fā)酵條件：灰樹花種子液按5%接種量接入含不同碳、氮源試驗培養(yǎng)基中，26℃，140 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)6 d，抽濾，65℃烘干，稱量菌絲體干重即為菌絲體生物量。

1.2.1.2 正交試驗設(shè)計

以單因素試驗中最適碳源、氮源以及葡萄糖和接種量為四因素，按L9（34）設(shè)計4因素、3水平正交試驗進行復選，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成9個配方，見表2。

1.2.1.3 100 L發(fā)酵罐中試試驗

按優(yōu)化后的配方配制培養(yǎng)基，裝液量60 L，以10%接種量接種種子液，攪拌速度140 r/min，通氣比1∶0.5（體積比），培養(yǎng)約120 h后，以還原糖不再下降、pH出現(xiàn)回升時終止發(fā)酵，放罐。測定菌絲體生物量和多糖總產(chǎn)率。

1.2.2 灰樹花多糖的提取

菌絲體粗多糖提取試驗流程：菌絲體烘干粉碎篩→加水→輔助提取→水浴提取→過濾→濾液濃縮→醇沉→干燥→提取物

發(fā)酵液粗多糖提取流程：發(fā)酵液→濃縮→醇沉→干燥→提取物

水提法提取多糖的試驗：樣品為烘干后的灰樹花菌絲體，粉碎過80目篩，以料水比、提取時間、提取溫度為不同的因素。因素水平設(shè)置如下：料水比為1∶10，1∶20，1∶30；提取時間為0.5 h，1 h，1.5 h；提取溫度為80℃，90℃，100℃。按照不同的處理提取多糖，提取液抽濾，濃縮至約1/10體積，4倍體積無水乙醇4℃醇沉，沉淀干燥，得提取物。測定樣品中的粗多糖含量。

輔助法提取多糖的試驗：以不同的輔助方法對樣品進行處理，然后以水提法進行粗多糖的提取。比較不同的輔助方法所對應多糖提取率，同時每個方法中選取不同的因素水平，每個水平作三個平行試驗，考察在上述試驗中不同的因素水平處理對多糖提取結(jié)果的影響。

超聲輔助提?。簶悠泛娓煞鬯楹螅?5℃超聲提取10 min，20 min，30 min。料水比設(shè)置1∶10，1∶20，1∶30，而后100℃沸水浴提取1 h，合并濾液濃縮至1/10體積，加入4倍體積無水乙醇沉淀，4℃靜置，3000 r/min離心15 min，取沉淀干燥，得提取物。計算樣品中的粗多糖含量。試驗基準條件為料水比1∶20，超聲提取20 min。

微波輔助提取：樣品烘干粉碎，加水，料水比1∶20，850 W，微波加熱 5 min，10 min，15 min，然后按上述水提法進行粗多糖的提取，測定樣品中粗多糖含量。

爆破提取法：樣品烘干粉碎，加水，料液比1∶20，通蒸汽升壓，壓力設(shè)置為 0.8 MPa，1.2 MPa，1.6 MPa，維壓時間選擇5 min，10 min，15 min。迅速放壓后得爆破渣和爆破液，混合后以水提法進行粗多糖的提取，得提取物。測定樣品中的粗多糖含量。試驗基準條件為壓力1.2 MPa，維壓時間20 min。

1.2.3 計算方法

菌絲生物量（g/100 mL）：液體發(fā)酵后混合液抽濾，取菌絲體105℃烘干至恒重，稱重。

粗多糖的提取率（%）：采用一定的提取方法進行多糖提取后測算出樣品中粗多糖的含量，試驗中粗多糖的含量測定均采用硫酸蒽酮法[5]。

粗多糖提取收率（%）=提取物中的多糖質(zhì)量/樣品中多糖質(zhì)量×100

粗多糖的總產(chǎn)率（g/L）=菌絲體生物量（g/L）×菌絲體中粗多糖的含量（%）+發(fā)酵液中粗多糖的含量（g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶液體發(fā)酵試驗結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

由表1可見，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2%玉米粉為碳源，搖瓶液體發(fā)酵后灰樹花菌絲體生物量同比最高，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%豆餅粉為氮源時，搖瓶液體發(fā)酵菌絲體生物量同比最高，因此選擇玉米粉和豆餅粉作為優(yōu)選后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源。

表1 不同碳氮源對灰樹花液體發(fā)酵菌絲體生物量的影響

2.1.2 液體發(fā)酵正交試驗結(jié)果

葡萄糖作為可快速利用的速效碳源，對菌絲體前期的生長具有重要作用，接種量直接影響液體發(fā)酵的時間和生物量，因此選擇豆餅粉、玉米粉、葡萄糖的添加量和接種量的作為正交試驗的四因素，以四因素三水平進行如下正交試驗設(shè)計。

表2 正交試驗因素及水平

由表3可見，對試驗中液體發(fā)酵菌絲體生物量影響最大的因素為C接種量（對應的R值最高），由表3中K值顯示試驗最佳組合A1B3C3D2，即豆餅粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，接種量10%。因此，搖瓶液體發(fā)酵試驗中篩選到的最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件為，豆餅粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，水 1000 mL，pH 自然。發(fā)酵條件：26℃，140 r/min搖床培養(yǎng)10 d。經(jīng)過驗證試驗，灰樹花搖瓶液體發(fā)酵生物量為1.210 g/100 mL，此時菌絲體多糖的產(chǎn)率達到0.78 g/L。

2.2 灰樹花粗多糖的提取結(jié)果

水提法多糖提取試驗結(jié)果見表4。

采用單因素試驗方法。由表4可見，水提法提取多糖適宜的料水比為1∶20，此時對應的粗多糖提取率最高，為4.46%；在提取時間0.5～1.5 h，粗多糖提取率總體隨提取時間的增長而增長，呈現(xiàn)先增長迅速，而后增長緩慢的趨勢，適宜的提取時間為1.5 h；粗多糖提取率隨提取溫度的升高呈上升趨勢，在100℃時相應的粗多糖含量最高。因此，試驗確定的適宜的提取參數(shù)為料水比1∶20，提取時間1.5 h，100℃提取。

表3 正交試驗數(shù)據(jù)

由表5可見，超聲、微波和爆破輔助提取法對于提高灰樹花多糖提取率均有一定的促進作用，其中超聲輔助提取的效果最好，其次為爆破輔助提取法。在超聲輔助提取時，提取時間選擇30 min左右效果較好，此時粗多糖提取率達到4.81%，爆破輔助提取時壓力選擇為1.5 MPa，維壓時間30 min效果較好，微波加熱時間選擇在15 min時效果較好。超聲輔助提取30 min時粗多糖提取率比對照CK（單一水提法）提高了9.32%。

表4 水提法提取灰樹花多糖試驗結(jié)果

表5 多種輔助方法多糖提取的比較試驗

3 小結(jié)與討論

以100 L發(fā)酵罐進行灰樹花液體發(fā)酵中試驗結(jié)果顯示，采用試驗優(yōu)選出的培養(yǎng)基配方：豆餅粉0.75%，玉米粉2.5%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.001%，水1000 mL，pH自然。接種量10%，攪拌速度140 r/min，26℃，培養(yǎng)120 h，灰樹花菌絲體干重達到21.97 g/L，灰樹花總多糖的產(chǎn)率達到3.29 g/L。

在灰樹花液體發(fā)酵生產(chǎn)過程中，灰樹花多糖的產(chǎn)率及質(zhì)量受菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和工藝的影響較大，后續(xù)需要繼續(xù)進行放大試驗和多糖產(chǎn)品分離純化、結(jié)構(gòu)功效的研究，以期實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

試驗結(jié)果表明超聲輔助水提法，適合應用于灰樹花多糖的提取，效果較好。具體工藝和參數(shù)為：菌絲體粉碎后過80目篩，加水，料水比1∶20，45℃超聲提取30 min，而后100℃提取1.5 h，提取液過濾，濃縮至1/10體積，4倍體積無水乙醇沉淀，干燥得提取物。經(jīng)測定灰樹花多糖的提取率達到85%，提取物的多糖純度為65%，蛋白肽的含量為30%左右，因蛋白肽具有較高的藥理保健作用，在試驗中未進行蛋白肽的去除。

近年來有不同研究者先后利用微波法、酶法、蒸汽爆破法等方法進行真菌多糖的輔助提取，各種方法各有優(yōu)勢，對多糖的提取均起到了一定的促進作用。多糖提取工藝的設(shè)計優(yōu)化，要綜合考量平衡提取效率、生產(chǎn)能耗成本、工藝設(shè)備簡便及可操作性等因素，以提高提取技術(shù)方法的市場競爭力，為實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。超聲輔助灰樹花多糖提取工藝具有提取效率較高、設(shè)備較為簡便、提取時間較短以及能耗較低等優(yōu)點，該技術(shù)適合進行推廣應用。