駱 燕

（山西安弘檢測技術有限公司，山西太原030000）

金針菇（Flammulina velutipes）是中國最早栽培的食用菌之一，具有種類繁多的特點，中國如今已成為世界上金針菇產量和出口量最多的國家[1-2]。

漆酶早在1883年發(fā)現(xiàn)于日本的漆樹中，它在木質素降解過程中起著重要的作用，屬于多銅氧化酶家族，能在氧氣作為電子受體的條件下氧化酚類或芳胺類化合物[4]。此外，經過長期的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶廣泛存在于細菌、真菌、植物、昆蟲中[5-6]。對其性質和作用進行研究后發(fā)現(xiàn)，漆酶在食品工業(yè)、造紙業(yè)、環(huán)境保護過程中都起著重要的作用，從而促進了漆酶的進一步研究。

漆酶作為環(huán)境污染物的最佳處理酶種之一，在木質素的降解過程中起著非常重要的作用。國內外有關漆酶產生菌的報道也越來越多，高等真菌漆酶是由擔子菌的白腐菌分泌。白腐菌包括煙管菌、白囊耙齒菌、射脈菌、糙皮側耳、靈芝、朱紅密孔菌、云芝菌，其漆酶都具有很強烈的染料脫色能力[7]。因此，筆者對山西農業(yè)大學食用菌中心提供的一株高產漆酶菌株F0027進行鑒定，并對子實體培養(yǎng)料菌渣中的漆酶酶學性質及染料脫色能力進行初步研究，現(xiàn)將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株F0027，由山西農業(yè)大學食用菌中心提供。

1.2 試劑

DNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；ABTS[2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽]購自Sigma公司；其他生化試劑或化學試劑均為進口或國產分析純。

1.3 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g∕L，葡萄糖 20 g∕L，KH2PO40.3 g∕L，MgSO4·7H2O 0.15 g∕L，瓊脂 18 g∕L，pH自然。

培養(yǎng)料：棉籽殼80%，麩皮15%，玉米粉3%，糖1%，石膏粉1%。

1.4 產漆酶菌株的鑒定

1.4.1 菌株分離

將分離活化F0027菌株接種于滅菌后的培養(yǎng)料中，23℃培養(yǎng)30 d，菌絲即可長滿瓶。隨后，將菌絲體生長的溫度控制在23℃，出菇階段將溫度控制在15℃，待出菇結束后留培養(yǎng)料備用。

1.4.2 形態(tài)學鑒定

參照《真菌鑒定手冊》（魏景超1979）和《微生物分類學》（張紀中1990）對黃色金針菇的形態(tài)學進行初步鑒定。

1.4.3 分子生物學鑒定

產漆酶菌株基因組DNA的提取運用了CTAB法[8]。ITS基因的PCR擴增：擴增時采用真菌通用引物對 ITS1∕ITS4。具體序列為 ITS1：TCCGTAGGTAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應體系：ddH2O 17.7 μL，10×buffer 2 μL，引物各 1 μL，模板 DNA1 μL，Taq 酶 0.3 μL，dNTP 2 μL。PCR反應條件：94℃變性3 min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。將擴增條帶膠回收后，送交上海生工公司測序。測序后所得序列提交GenBank中進行BLAST比對[9]。

1.4.4 漆酶活性的測定

培養(yǎng)料殘渣中加入適量蒸餾水放入研缽中研磨成勻漿，在1359×g的條件下離心15 min，收集上清液測定酶活性，每個樣品重復3次。采用ABTS法[10-13]對漆酶的酶活性進行測定，將等體積的酶液與10 mmol∕L的含有ABTS的醋酸鈉緩沖溶液混合。將5 μL漆酶樣品加入195 μL底物ABTS溶液（pH 4.6）中混合均勻，置于25℃水浴鍋中反應10 min，加入300 μL 5%的TCA（三氯乙酸）溶液終止反應，測定420 nm處的吸光度。對照組用5 μL去離子水代替5 μL漆酶樣品，其余的條件相同。酶活力單位定義為：在420 nm處，每分鐘每毫升反應體系產生一個吸光值所需要的酶量為一個酶活力單位。所有的試驗均重復3次。

1.5 產酶特性試驗

取F0027出菇結束后培養(yǎng)料殘渣于研缽中，加入適量蒸餾水，用力研磨后移入離心管中，于4℃、1359×g的條件下離心15 min，最后收集上層清液，測定漆酶、蛋白酶、核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶的活性。以ABTS為底物測定漆酶的活性[14]；以Casein為底物測定蛋白酶的活性[15]；以酵母tRNA為底物測定核糖核酸酶的活性[16]；以對硝基苯酚為底物測定α-半乳糖苷酶的活性[17]。

1.6 漆酶酶學性質研究

1.6.1 漆酶最適pH

選用醋酸鈉緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液作為緩沖體系進行漆酶活力的測定。然后取一定量的粗酶液，將其與等體積不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）緩沖溶液（0.1 mol∕L）配置的ABTS溶液混合均勻，在25℃下測定酶活力，以酶活力最高值為100%，以各pH下相對酶活力對pH作圖。每組做3個重復。

1.6.2 漆酶最適溫度

將5 μL漆酶加入195 μL用最適pH緩沖液配制的ABTS溶液中，分別在4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃水浴中反應10 min，加入300 μL 5%的TCA終止反應，測定420 nm波長下的吸光值。每組做3個重復。以酶活性最高值為100%，以各溫度下的相對活力對相應的溫度作圖。

1.6.3 金屬離子對漆酶活性的影響

將K+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Cr2+、Mn2+、Al3+、Zn2+和Fe2+的氯化物用去離子水配制成20 mmol∕L的母液，加入漆酶樣品中，使各種金屬離子的終濃度分別達到1.25 mmol∕L、2.5 mmol∕L、5 mmol∕L 和 10 mmol∕L，混合均勻，于4℃下孵育1 h，然后按照1.4.4所述的方法測定酶活性，每組做3個重復。以未與金屬離子孵育的漆酶活性為100%，以此計算此菌株漆酶經各種金屬離子處理后的相對酶活性。

1.6.4 化合物對漆酶活性的影響

將抗壞血酸、草酸、尿素、EDTA用去離子水配制成20 mM的母液，加入漆酶樣品中，使各種化合物的終濃度分別達到1.25 mmol∕L、2.5 mmol∕L、5 mmol∕L、10 mmol∕L，混合均勻，于4℃、pH4.6的條件下孵育1 h，然后按照1.4.4所述的方法測定酶活性，每組做3個重復。以未與化合物孵育的漆酶活性為100%，以此計算此菌株漆酶經各種化合物處理后的相對酶活性。

1.6.5 漆酶的染料脫色能力

選擇溴百里酚藍、鉻黑T和孔雀石綠這3種實驗室染料來評估漆酶的脫色能力。利用紫外可見分光光度法在不同的波長下測定最大吸光度，利用得到的OD值即可計算得到漆酶對于染料的脫色率。反應體系為：將10 μL漆酶樣品加入490 μL染料溶液中，30℃水浴反應。每個反應體系設置3個重復，對照組中用熱滅活的漆酶樣品代替10 μL漆酶樣品。分別在4 h、12 h和24 h時定時取樣，測定各染料在最大吸收波長處的吸光度（A2），同時測定對照組吸光度（A1），脫色率計算公式[18]為：

A2為初始溶液的吸光度，A1為反應后溶液的吸光度[18]

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學鑒定

將菌株F0027在PDA斜面培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d。觀察菌絲體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其為白色絨毛狀菌絲體，具粉質感，有爬壁現(xiàn)象（圖1）。將菌絲體接種于培養(yǎng)料上23℃培養(yǎng)，出菇后觀察其子實體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，菌蓋較白色金針菇大，金黃色，邊緣乳黃色且有細紋，菌肉白色，成簇密集彎曲生長，不等長；菌柄有黃褐色的絨毛，內部松軟，呈纖維質（圖2）。

2.1.2 分子生物學鑒定

圖1 菌絲體形態(tài)

圖2 子實體形態(tài)

圖3 野生菌菌絲體r DNA ITS序列凝膠電泳圖

圖4 pH對菌株F0027漆酶活性的影響

圖5 溫度對菌株F0027漆酶活性的影響

對該菌株的培養(yǎng)料殘渣收集后經提取酶液，測定其漆酶活性為315.38 U∕mL。然后用CTAB法提取DNA，并對該菌株的ITS序列進行測定，獲得DNA部分片段的大小為750 bp（圖3）。將該序列在Gen-Bank中進行BLAST同源性比較，發(fā)現(xiàn)與GenBank中報道過的1株Flammulina velutipes（登錄號：KR673332）同源性達99%以上。因此，經rDNA-ITS序列分析以及形態(tài)特征的分析可知，該菌株初步被鑒定為黃色金針菇。

2.2 產酶種類及活性

經酶液提取后，該上層清液中不同種類的酶活性測定結果如表1所示。由表1可見，F(xiàn)0027菌株為高產漆酶菌株。

表1 菌株F0027酶及酶活性測定

2.3 漆酶最適pH

測定了pH 3.0～9.0漆酶的酶活性，用相對酶活性繪制曲線。結果顯示，pH為4.8時，漆酶擁有最大的漆酶活性（圖4）。酶液在pH4.6～5.0，酶活性較高；當pH大于9時，酶活性完全喪失。與大多數(shù)的真菌漆酶一樣，酸性條件下其漆酶活性較高。

2.4 漆酶最適溫度

在pH4.8的條件下，測定不同溫度下的漆酶活性，用相對酶活性繪制曲線。結果表明，殘渣中漆酶的最適反應溫度為35℃（圖5）。

2.5 金屬離子對漆酶活性的影響

F0027菌株培養(yǎng)料殘渣中漆酶對于金屬離子的敏感性見表2。由表2可見，K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+對漆酶活性幾乎無影響；Cr2+、Al3+對漆酶活性有不同程度的抑制作用；Cu2+對漆酶活性的促進作用不明顯，F(xiàn)e2+對漆酶活性有強烈的抑制作用，且10 mmol∕L的Fe2+可以完全抑制漆酶的活性。

表2 金屬離子對漆酶活性的影響

2.6 化合物對漆酶活性的影響

表3表明，不同濃度的抗壞血酸均可完全抑制漆酶活性；草酸和EDTA對漆酶活性有強烈的抑制作用，且10 mmol∕L的草酸和EDTA可以完全抑制漆酶活性；尿素對漆酶活性幾乎無影響。

表3 化合物對漆酶活性的影響

2.7 漆酶的染料脫色能力

在紡織工業(yè)中，運用物理和化學方法對染料進行脫色既昂貴又低效。所以酶法脫色有著極大的益處。黃色金針菇漆酶對于不同的實驗室染料具有不同的脫色率。該漆酶對于依來鉻黑染料的脫色能力最強，在4 h、12 h、24 h后脫色率均在30%以上，且脫色率分別為37.8%、31.0%、32.0%（表3）。

表4 漆酶對3種染料的脫色率

3 小結與討論

經分離鑒定得高產漆酶菌株F0027，經形態(tài)學分析和ITS測序及同源性比對鑒定為黃色金針菇。經對其培養(yǎng)料殘渣進行漆酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)其為高產漆酶菌株。對其產漆酶酶學性質進行初步研究表明，該菌株漆酶的最適溫度與內生真菌Monotosporasp.漆酶的最適溫度相似（30℃）[19]，然而該溫度比菌株Trametessp.漆酶的最適溫度低（75℃）[20]。與大多數(shù)真菌漆酶類似，該漆酶在酸性環(huán)境下的活性較高，在堿性環(huán)境下明顯失活[21]。

金屬離子對F0027產漆酶能力有不同程度的影響，其中K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+對漆酶活性幾乎無影響；Cr2+和Al3+對漆酶活性有不同程度的抑制作用；Fe2+會強烈抑制黃色金針菇的漆酶活性；該漆酶活性因低濃度的銅離子（1.25～5 mmol∕L）而增加，因高濃度銅離子而降低，該結果與ZHANG G Q等[5]、GUAN G P等[22]的研究相似，但 DALEL D等[23]和YOUNES S B等[24]研究發(fā)現(xiàn)Trametessp.和Symbio-bacterium thermophilum的漆酶會受到Cu2+的抑制，這種抑制作用可能是因為金屬離子改變了漆酶活性部位的構象而引起的[25]。而且，漆酶完全受到抗壞血酸的抑制，這種抑制作用已經在漆酶中有所報道[26]。抑制劑EDTA對該酶具有強烈的抑制作用，在濃度為10 mmol∕L時可完全抑制漆酶活性，結果與抑制劑EDTA對紫杉木尺菌漆酶活性影響結果不同[13]；草酸對漆酶有抑制作用，結果與草酸對雜優(yōu)-2平菇漆酶活性的影響結果相同[26]。

白腐真菌漆酶[27]、Lamprospora wrightii漆酶[28]都可以促使染料脫色。研究表明，F(xiàn)0027金針菇漆酶可以使溴百里香酚藍、依來鉻黑、孔雀石綠3種實驗室染料脫色。4～12 h，F(xiàn)0027漆酶對依來鉻黑染料的脫色率均在30%以上。另外，24 h后，依來鉻黑和孔雀石綠的脫色率比4 h時低，這一結果與Russula virescens漆酶對一些染料的脫色效果相同[18]，這可能是因為隨著脫色時間的增加，游離酶越來越少，酶與底物結合量減少，所以延長時間也不能增加染料的脫色率。

F0027金針菇漆酶在酸性和較低溫度環(huán)境下具有較高活性。雖然該漆酶對依來鉻黑的脫色能力最好，但是脫色率低于Russula virescens漆酶對于依來鉻黑的脫色率（＞50%）[18]。因此，該漆酶在工業(yè)方面應用有待進一步研究。

F0027金針菇栽培條件可控、生長旺盛，并且該菌株生長過的培養(yǎng)料中的漆酶含量最高，這一點給今后商業(yè)生產中漆酶的應用提供了依據(jù)，并且從黃色金針菇培養(yǎng)料中提取漆酶的成本低于目前已經商業(yè)化的其他食用菌中提取成本。