阿爾祖古麗·阿卜杜外力，玉素甫·蘇來曼，巴吐爾·阿不力克木

（新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

生姜蛋白酶在食品工業(yè)中的應用主要是嫩肉劑、酒澄清劑、乳制品凝固劑以及大豆蛋白粉等食品添加劑[1,2]。生姜蛋白酶用于肉制品嫩化，不僅可以提高嫩度，還可以使其具有良好的風味，它是通過降解肌原纖維，導致肌原纖維的斷裂而提高肉類的嫩度[3,4]。俞沛初等[5]通過對雞肉、牛肉中添加不同劑量生姜汁實驗，初步探明生姜汁對肉類有明顯的致嫩效果。唐曉珍[6]報道了生姜汁和生姜蛋白酶對豬肉的嫩化效果，并指出生姜汁可以直接在肉類嫩化中應用，確定了生姜蛋白酶嫩化豬肉的最適條件。Naveena等[7]研究了姜汁對印度水牛肉的嫩化效果，結果表明，姜汁處理增加了肉樣膠原蛋白溶解度，促進了肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白的分解，降低了剪切力，肌肉蛋白質的電泳圖中蛋白條帶數量減少，表明生姜蛋白酶具有廣泛的蛋白水解能力。孫國梁等[8]研究了生姜蛋白酶對牛肉的嫩化效果試驗，對酶用量、pH值、處理溫度、處理時間進行了測試，結果表明，生姜蛋白酶對牛肉的嫩化效果十分顯著，通過正交試驗確定生姜蛋白酶對牛肉嫩化的最佳工藝條件：酶用量為0.06%，pH為7.0，處理溫度為50 ℃，處理時間為2 h。

獼猴桃蛋白酶可用作為嫩肉劑、酒澄清劑等，也可用于新鮮奶酪的生產[9]；而且它可以代替木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶用作啤酒澄清劑[10]。近年來，有些學者已報道，獼猴桃蛋白酶在肉類嫩化的初步應用，并研究證明獼猴桃蛋白酶比木瓜蛋白酶具有更好的嫩化效果[11,12]；Aminlari等[13]研究獼猴桃蛋白酶對牛肉的影響，發(fā)現獼猴桃蛋白酶對牛肉作用比其他植物巰基蛋白酶要溫和。Han等[14]研究發(fā)現用獼猴桃汁對腌肉制品具有嫩化效果。獼猴桃蛋白酶還具有助于防止果凍凝固、美容祛斑等功能[15]。目前，市場上的嫩肉粉主要由菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶以及無花果蛋白酶制作而成的，均含巰基肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強水解能力以及合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質[16]。但國內對于獼猴桃蛋白酶的研究鮮少，因此對猴桃蛋白酶的研究利用，不僅可以開發(fā)利用天然資源，也為其在食品領域的應用提供理論依據，增加新的酶源。

干腌羊火腿是通過選料，經修整腿坯、低溫腌制、洗脫、風干、發(fā)酵和成熟等一系列過程制作而成，并其獨特的風味日益受消費者歡迎。但因產品加工周期長、成本高、受特殊地區(qū)氣候條件限制，會影響火腿工業(yè)化生產。目前有關干腌火腿的研究主要集中在改善其生產工藝和內原酶對其風味的影響方面[17]；而利用外源酶，提高其嫩度并縮短加工成熟期的研究尚未報道。

本實驗以新鮮綿羊后腿為材料，添加生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶等植物蛋白酶，通過檢測TN含量、NPN含量和PI等蛋白質降解指標，結合SDS-PAGE電泳分析其對肌肉蛋白質降解的影響，為日后干腌羊火腿的工業(yè)化生產以及工藝改進提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉：選用新疆巴什拜羊，6～9月齡公羊鮮后腿，由新疆謝利蓋畜牧有限公司購置。

生姜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg）和獼猴桃蛋白酶（酶活力≥500 U/mg），購自上海鼓臣生物技術有限公司。

藥品試劑：二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鎂、氯化鉀、EGTA、迭氮鈉、Triton-X-100、氯化鈉、Tris、鹽酸、甘油、SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍、甲醇、冰醋酸、考馬斯亮藍R-250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨，TEMED等。

1.2 儀器與設備

85-2A雙向恒溫磁力攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；BECKMAN Avanti-J-26S XPI落地式高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter有限公司；FSH-2可調高速勻漿機，武漢格萊莫檢測設備有限公司；Food ALYT D4000凱氏定氮儀，德國 OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co.KG公司；DYY-7C型電泳儀，北京市六一儀器廠；TY-80R脫色搖床，金壇市醫(yī)療儀器廠；200L-1200L真空滾揉機，諸城信通食品機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌羊火腿加工及制樣

鮮羊后腿（2.5～3.0 kg左右）→冷涼修整（去除可見脂肪并修胚）→腌制（3%食鹽、0.01%亞硝酸鈉、0.5%蔗糖，4～8 ℃，3 d）→酶處理（分三組，每組3個重復，一組為對照組(注射10 mL蒸餾水作對照)，一組注射0.05%的獼猴桃蛋白酶，一組注射0.05%的生姜蛋白酶，注射前將兩個蛋白酶粉末分別溶解在10 mL蒸餾水中，用醫(yī)用注射器注射，并滾揉，50 ℃下處理1.5 h）→浸泡洗刷（4 ℃的水，浸泡2 h）→吊掛風干（前期風干：10～12 ℃、RH 80%～85%、風速0.8 m/s、5 d，中期風干：10～12 ℃、RH 75%～80%、風速 0.8 m/s、7 d，后期風干：14～15 ℃、RH 75%～85%、風速 0.8 m/s、8 d）→成熟（16～18 ℃、RH 70%～75%、風速0.5 m/s、7 d）→成品

以上過程共需30 d。

1.3.2 取樣階段

以羊腿股二頭肌為取樣點，每組分別從原料腿（0 d）、腌制結束（3 d）、風干前期（8 d）、風干中期（15 d）、風干后期（23 d）、成熟期（30 d）等六個工藝點取樣，置于-20 ℃冷凍保藏，以備各指標的測定。

1.3.3 肌漿蛋白的提取

肌漿蛋白的提取參考Molina I等[18]的方法：準確稱取5 g肉樣，加入15 mL 0.2 mol/L，pH 6.5的PBS（甲液：NaH2PO4·2 H2O 31.21 g/L；乙液：Na2HPO4·12 H2O 71.64 g/L；甲：乙=1：2）混合均勻，在冰浴條件中4000 r/min勻漿10 min后，再10000 r/min 4 ℃離心20 min，上清液即為肌漿蛋白提取液。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

參考Fadda S等[19]的方法并略作修改。第一步：取5 g肉樣剪碎于50 mL離心管中，加15 mL標準鹽溶液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L KH2PO4、2 mmol/L MgCl2·6H2O、2 mmol/L EGTA、1 mmol/L NaN3）勻漿20 s，2000 r/min離心15 min，棄上清（含CAF和肌漿蛋白），此步驟重復4次；第二步：向沉淀中加15 mL標準鹽溶液+1% Triton X-100勻漿10 s，離心 4000 r/min離心10 min，棄上清取沉淀，并重復3次；第三步：沉淀中加入10 mL，0.01 mol/L KCl溶液，用玻璃棒劇烈攪拌，4000 r/min離心10 min，重復3次；第四步：沉淀中加入8倍體積的100 mmol/L NaCl溶液，劇烈震蕩，使沉淀懸浮于溶液中，4000 r/min離心5 min，取沉淀，重復兩次；沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.5 蛋白質降解指數的測定

蛋白質水解指數(PI)：是指NPN占TN的百分比。TN含量測定：參照GB5009.5-2016凱氏定氮法。NPN含量測定：參考朱健輝[20]的方法，并略作修改。將樣品自然解凍后，剔除可見脂肪和結蹄組織，切碎，稱取5 g左右（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，高速勻漿機勻漿3次，于4 ℃下放置1 h后，3000 r/min離心15 min，用快速濾紙過濾，取10 mL濾液加入等體積的10%三氯乙酸混合均勻，室溫靜置30 min，2500 r/min離心15 min，過濾，取10 mL濾液用凱氏定氮消化。

1.3.6 SDS -PAGE電泳

取肌原纖維沉淀加入2倍體積的蒸餾水，用高速勻漿機勻漿15 min，4 ℃過夜。分別取肌漿蛋白和肌原纖維蛋白樣品 400 μL，加入 100 μL 5×的 SDS-PAGE樣品處理液(10 mL 0.06 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，5 mL甘油，1 g SDS，2.5 mLβ-巰基乙醇，0.05 mg溴酚藍，加蒸餾水定容至50 mL)，混勻，在沸水中煮沸5 min，冷藏備用，在使用前再加熱2 min。

分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，進樣量為10 μL，電泳槽中加入電泳緩沖液（Tris 3.04 g、甘氨酸14.42 g、SDS1 g、用蒸餾水溶解、調pH 8.3后定容至1000 mL），開始電壓為80 V，進入分離膠后電壓加大至170 V，需1～2 h。

電泳結束后，取出凝膠于染色液（甲醇：冰醋酸：水=4：1：5，0.1%考馬斯亮藍R-250）中，并置于搖床上染色40 min。

染色完后倒掉廢液加入脫色液（甲醇：冰醋酸：水=1：1：8），在脫色搖床上進行脫色至背景清晰。

1.3.7 數據統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel軟件進行數據統(tǒng)計分析，用SPSS19.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同酶處理對蛋白質降解指數的影響

2.1.1 對TN含量的影響

圖1 在風干過程中干腌羊火腿TN含量的變化Fig.1 Changes in total nitrogen content of dry-cured mutton ham during drying processing

由圖1可知，隨著風干階段的延長，各組干腌羊火腿TN含量總體呈上升趨勢。腌制期各組TN含量呈下降趨勢，這可能是上鹽過程中水溶性蛋白不斷流失所引起的；而在后期加工過程中逐漸回升，這是與Buscailhon[21]的研究結果一致。獼猴桃蛋白酶處理組和生姜蛋白酶處理組羊火腿的TN含量顯著高于對照組，說明外源植物蛋白酶可以促進羊火腿肌肉蛋白質的降解[22]。干腌羊火腿到成熟期時，對照組、獼猴桃蛋白酶處理組和生姜蛋白酶處理組 TN含量分別為3.59 g/100 g、4.32 g/100 g和4.73 g/100 g，其中生姜蛋白酶處理組TN含量最高，是對照組的1.3倍，差異顯著（p＜0.05）；其次是獼猴桃蛋白酶處理組，是對照組的1.2倍；說明生姜蛋白酶對干腌羊火腿肌肉蛋白質降解的影響比獼猴桃蛋白酶要大。

2.1.2 對NPN的影響

隨著風干階段的延長，各組干腌羊火腿 NPN氮含量呈上升趨勢（圖2）。獼猴桃蛋白酶處理組和生姜蛋白酶處理組干腌羊火腿NPN含量顯著高于對照組，說明外源植物蛋白酶能促進蛋白質降解成小肽和游離氨基酸，使 NPN呈現逐漸增加趨勢[23]。干腌羊火腿到成熟期時，對照組、獼猴桃蛋白酶處理組、生姜蛋白酶處理組的NPN含量從鮮羊腿的0.20 g/100 g分別上升為0.59 g/100 g、0.90 g/100 g、0.99 g/100 g。由此可知，生姜蛋白酶處理組NPN含量比其余兩組要高，是對照組的1.7倍；獼猴桃蛋白酶處理組NPN含量為對照組的1.5倍；說明兩種植物蛋白酶都能不同程度促進蛋白質降解成小肽和游離氨基酸，從而增加NPN含量；且生姜蛋白酶的降解速度較獼猴桃蛋白酶快。

圖2 在風干過程中干腌羊火腿NPN含量的變化Fig.2 Changes in non-protein nitrogen content of dry-cured mutton ham during drying processing

2.1.3 對PI的影響

圖3 在風干過程中干腌羊火腿PI的變化Fig.3 Changes in proteolysis index of dry-cured mutton ham during drying process

由圖3可知，隨著風干階段的延長，干腌羊火腿PI呈上升趨勢。獼猴桃蛋白酶處理組和生姜蛋白酶處理組干腌羊火腿PI顯著高于對照組，并在各階段差異顯著（p＜0.05）。干腌羊火腿到成熟期時，對照組、獼猴桃蛋白酶處理組、生姜蛋白酶處理組的PI從鮮羊腿的 7.18%分別上升為成熟期的 16.30%、20.83%、21.06%等；與對照組相比，獼猴桃蛋白酶處理組和生姜蛋白酶處理組分別上升了1.27倍和1.29倍；說明兩種蛋白酶都在不同程度上提高了干腌羊火腿的PI，而且生姜蛋白酶處理組的降解程度較大[24]。

圖4 風干過程中對照組干腌羊火腿肌漿蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein of dry cured mutton ham of control group during drying process

圖5 風干過程中獼猴桃蛋白酶處理組干腌羊火腿肌漿蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein of dry cured mutton ham of actinidin treatment group during drying process

圖6 風干過程中生姜蛋白酶處理組干腌羊火腿肌漿蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein of dry cured mutton ham of zingibain treatment group during drying process

2.2 不同酶處理對肌漿蛋白的影響

由圖4可知，對照組干腌羊火腿在風干過程中，肌漿蛋白發(fā)生了降解；分子量66.2 ku～26.0 ku處的蛋白條帶逐漸變細，但變化不大，而到成熟期（30 d）時明顯變細；20.0 ku處的蛋白條帶逐漸變粗；14.4 ku處的條帶變化不明顯。分子量為66.2 ku和45.0 ku中間出現的條帶，隨著風干過程的延長逐漸變弱；33.0 ku和26.0 ku中間的條帶逐漸變暗甚至消失；26.0 ku～20.0 ku和20.0 ku～14.4 ku中間的出現的條帶逐漸變粗、顏色加深，這與高分子蛋白降解產生新的蛋白片段有關。

由圖5可知，在風干過程中，獼猴桃蛋白酶處理組干腌羊火腿肌漿蛋白發(fā)生了降解現象，而且降解程度較對照組大。整體來看，獼猴桃蛋白酶處理組干腌羊火腿的蛋白條帶較對照組暗；分子量 66.2 ku～45.0 ku和33.0 ku～26.0 ku中間小的蛋白條帶已消失；45.0 ku～33.0 ku中間的條帶逐漸變細，到成熟期（30 d）時消失；20.0 ku附近的條帶逐漸變粗；說明獼猴桃蛋白酶可以降解干腌羊火腿的高分子蛋白成低分子蛋白[25]。

由圖6可知，生姜蛋白酶處理組干腌羊火腿的肌漿蛋白隨著風干過程的延長發(fā)生了降解，且降解程度較對照組和獼猴桃蛋白酶處理組。分子量為 62.0 ku處的蛋白片段逐漸變弱，并下面出現了小的條帶；45.0 ku處的蛋白條帶逐漸變弱甚至消失；26.0 ku，20.0 ku，14.4 ku附近條帶有所增加；說明生姜蛋白酶可以對干腌羊火腿肌漿蛋白產生降解作用，并且降解程度較獼猴桃蛋白酶強。

2.3 不同酶處理對肌原纖維蛋白的影響

圖7 風干過程中對照組干腌羊火腿肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of myofibrillar protein of dry cured mutton ham of control group during drying process

圖8 風干過程中獼猴桃蛋白酶處理組干腌羊火腿肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE of myofibrillar protein of dry cured mutton ham of actinidin treatment group during drying process

圖9 風干過程中生姜蛋白酶處理組干腌羊火腿肌原纖維蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE of myofibrillar protein of dry cured mutton ham of zingibain treatment group during drying process

由圖7得知，對照組干腌羊火腿的肌原纖維蛋白發(fā)生了降解，但降解程度不大。分子量為63.0 ku～48.0 ku和48.0 ku～35.0 ku中間出現蛋白條帶逐漸變粗；35.0 ku～25.0 ku中間出現了很多小的蛋白條帶；25.0 ku～20.0 ku、20.0 ku～17.0 ku和17.0 ku～11.0 ku中間產生的蛋白條帶逐漸變粗，顏色也逐漸加深，說明高分子蛋白降解產生了新的蛋白片段。

由圖8可知，隨著風干過程的延長，獼猴桃蛋白酶處理組干腌羊火腿的肌原纖維蛋白發(fā)生了降解情況，而且降解程度明顯大于對照組。分子量為 63.0 ku～48.0 ku和 48.0 ku附近的蛋白條帶逐漸變細；35.0 ku～25.0 ku中間的蛋白條帶有所增加，顏色也逐漸變深；25.0 ku～20.0 ku中間的的蛋白條帶逐漸變細；17.0 ku附近的蛋白條帶逐漸變粗；說明獼猴桃蛋白酶可以降解干腌羊火腿的肌原纖維蛋白。

由圖9可知，生姜蛋白酶處理組干腌羊火腿肌原纖維蛋白的降解程度較大，并且比對照組和獼猴桃蛋白酶處理組高。分子量為63.0 ku～48.0 ku的蛋白條帶逐漸變弱；48.0 ku附近的條帶逐漸消失；35.0 ku～25.0 ku中間的蛋白條帶到風干后期（23 d）和成熟期（30 d）時明顯增加；25.0 ku附近的蛋白條帶逐漸變細甚至消失；20.0 ku附近的條帶顏色逐漸加深；17.0 ku～11.0 ku中間產生的蛋白條帶逐漸變粗；說明生姜蛋白酶處理可以促進干腌羊火腿蛋白質的降解[26]。

3 結論

生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿肌肉蛋白質降解的影響顯著。通過檢測蛋白質降解指標，并SDS-PAGE電泳分析發(fā)現，獼猴桃蛋白酶和生姜蛋白酶都可以促進干腌羊火腿肌肉蛋白質的降解；研究結果發(fā)現，生姜蛋白酶的降解效率較獼猴桃蛋白酶強。