馬振華

（甘肅省家畜繁育改良管理站733000）

1 工作準(zhǔn)備

（1）檢測標(biāo)準(zhǔn)，牛冷凍精液檢測標(biāo)準(zhǔn)按照GB4143-2008中的技術(shù)要求和判定標(biāo)準(zhǔn)[1]，對(duì)0.25ml牛冷凍細(xì)管精液的容量、有效精子數(shù)、精子活力、畸形率、菌落數(shù)5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)項(xiàng)檢測。檢測嚴(yán)格按照“牛冷凍精液質(zhì)量檢測技術(shù)操作規(guī)程”完成。

（2）牛細(xì)管冷凍精液來源，甘肅省佳源畜牧生物科技有限責(zé)任公司庫房隨機(jī)批次抽取。檢測牛品種XM、XL、PA。

（3）檢測室環(huán)境，室內(nèi)保持清潔衛(wèi)生，整齊、安靜、無異味。室內(nèi)配備控溫、控濕設(shè)施，保證工作期間室溫能控制在20～25℃，相對(duì)濕度控制在35%～55%。工作時(shí)應(yīng)穿潔凈的工作服、鞋子，戴手套、口罩、帽子等。

（4）儀器設(shè)備，檢測儀器設(shè)備的數(shù)量、性能和精度能滿足檢測工作要求，完好率為100%。玻璃器皿類刷洗干凈消毒、干燥后備用。

（5）耗材試劑類，無論是一次性的還是可重復(fù)使用的都必須是無菌、無毒的?；瘜W(xué)試劑盡量使用分析純，培養(yǎng)基及染色試劑可選擇商品化的半成品。

2 精液檢測

2.1 劑量

每頭牛隨機(jī)抽取3支細(xì)管冷凍精液室溫解凍，剪去超聲波封口端，用細(xì)管專用推針把精液逐一推入小試管內(nèi)，用玻璃吸管與撿卵器連接后吸盡小試管內(nèi)的精液，讀取吸管內(nèi)精液量值，檢測每劑量細(xì)管凍精容量不少于0.18ml。

2.2 精子活力

2.2.1 精液解凍

每頭牛取3支細(xì)管冷凍精液置于37℃水浴中解凍40s，解凍后擦干水珠，用專用剪剪去超聲波封口端，細(xì)管精液專用推針把精液逐一推入試管內(nèi)，混勻活力≥35%。

2.2.2 目測法

用移液器取解凍精液約10uL置于載玻片的一端，為第一樣片，同樣方法取精液約10uL置于載玻片的另一端，為第二樣片，分別蓋上蓋玻片立即在顯微鏡（10×40）下觀察精子運(yùn)動(dòng)圖像。載物臺(tái)溫度應(yīng)保持在38℃。觀察部位選擇蓋玻片的中部，每個(gè)樣片觀察3個(gè)以上視野，觀察不同液層內(nèi)的精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行全面評(píng)定。至少觀察2個(gè)樣片，所有觀察樣片的平均值為最終評(píng)定結(jié)果。

2.2.3 前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)

精液解凍方法同2.2。用移液器吸取20μL精液注入盛有0.98ml的3.0%氯化鈉溶液的試管內(nèi)混勻。血球計(jì)數(shù)板用血蓋片將計(jì)數(shù)室蓋好，用移液器吸取10μL稀釋精液于血蓋片邊緣，使稀釋精液自行流人計(jì)數(shù)室，均勻充滿，無氣泡。

2.2.4 精子畸形率

（1）抹片，各牛均取精液1滴，滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈一定夾角，將樣品均勻地拖布于載玻片上。自然風(fēng)干5～10min，每樣品制作2個(gè)抹片。

（2）固定，在已風(fēng)干的抹片上滴上1.0～2.0ml中性福爾馬林固定液，固定15min后用清水緩緩沖去固定液，自然風(fēng)干。

（3）染色：將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢。

（4）鏡檢，將制備好的抹片在顯微鏡(400～600倍)下觀察，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子（分左、右兩個(gè)區(qū)），取兩片的平均值。

2.2.5 細(xì)菌數(shù)在超凈化工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，平皿蓋面標(biāo)記上每個(gè)牛的編號(hào)，75%酒精棉球擦抹整支細(xì)管，細(xì)管剪用酒精燈火焰消毒，剪去細(xì)管超聲波封口端，用細(xì)管推針將整支細(xì)管的精液注入平皿內(nèi)，及時(shí)將恒溫53℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾倒入平皿內(nèi)10～15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其與精液混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾倒入一沒有精液的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)48h[2]。為保持箱內(nèi)濕度和防止水分的過分蒸發(fā)，可放置一小燒杯水，到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間立即計(jì)數(shù)。

3 檢測結(jié)果

凍精檢測結(jié)果見附表。

4 小結(jié)

（1）凍精外觀和劑型、劑量檢測結(jié)果為100%合格。目前各公牛站均采用精液細(xì)管封裝機(jī)，只要設(shè)備正常使用，不會(huì)影響精液質(zhì)量。檢測精液密度每劑量有效精子數(shù)低于800萬個(gè)/劑，可通過精子密度測定儀調(diào)整[3]。精液處理室空氣采用負(fù)壓通風(fēng)方式，人員著消毒服進(jìn)入，生產(chǎn)結(jié)束后進(jìn)行全面清洗消毒操作臺(tái)面，細(xì)管分裝軟管，創(chuàng)造無菌環(huán)境可有效降低細(xì)菌數(shù)。

（2）做好種公牛早期培育與調(diào)教工作，嚴(yán)格控制體型防止形成草腹、保證公牛營養(yǎng)均衡合理供給，加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)不少于2h/d，不得粗暴對(duì)待公牛，防止套采，避免公牛應(yīng)激反應(yīng)，采精場保持安靜，采精器械、場地嚴(yán)格消毒，采取適宜的防滑措施，凡是接觸精液的器具都應(yīng)嚴(yán)格清洗消毒。稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用，雞蛋來源于無疫病的雞場，新鮮潔凈，冷藏保存，產(chǎn)后7d后的雞蛋不宜使用。避免夏季、冬季高溫和極寒冷天氣，陰雨雪和異常氣候天氣、種公牛免疫注射后15d，疾病治療期間均應(yīng)停止生產(chǎn)，影響精液質(zhì)量和種公牛健康。