邢宇俊，陸丹丹，吳季榮，徐劍宏，王園園，梁 杰，史建榮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標準重點實驗室/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室/江蘇省轉(zhuǎn)基因安全評價公共服務(wù)中心/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/中德農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評估技術(shù)研發(fā)中心,江蘇 南京 210014)

自從首例轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品被批準商業(yè)化生產(chǎn)以來，轉(zhuǎn)基因作物在不同的國家和地區(qū)開始大規(guī)模地商業(yè)化種植，截至2017年，全球24個國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到 1.898×108hm2[1]。越來越多的已批準的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品出現(xiàn)在市場上，比如：轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、苜蓿、木瓜、棉花、甜菜、馬鈴薯等[1]。但隨著轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)迅速發(fā)展，其環(huán)境和食品安全性問題一直受到人們的關(guān)注，因此，對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測有利于政府職能部門對其進行監(jiān)管和監(jiān)督。

目前，轉(zhuǎn)基因作物檢測的常用方法是提取檢測樣品的DNA，進行定性PCR[2]或定量PCR檢測[3]。在PCR檢測過程中，必須設(shè)置陰性對照和陽性對照，確保檢測結(jié)果的可比性、溯源性，標準物質(zhì)的作用十分重要[4-5]。檢測結(jié)果的可靠性、準確性、有效性需要陽性標準物質(zhì)(包括標準質(zhì)粒)作對照，因此陽性標準物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測中是不可缺少的。

雖然現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體比較多，但市場上銷售的標準物質(zhì)種類有限，價格比較高，很多標準品來自歐盟標準物質(zhì)與測量研究所(IRMM-CRL) 和美國油料化學(xué)家協(xié)會( AOCS)，種類主要包括轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、水稻、棉花、甜菜等60余種[6]。而國內(nèi)這些標準物質(zhì)主要依賴于進口，而且以植物原材料制備標準物質(zhì)非常復(fù)雜，不僅需要精密的儀器設(shè)備，而且對環(huán)境要求也比較高。雖然國內(nèi)也有部分轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)商業(yè)化，例如由中國計量科學(xué)研究院研制的Bt63，但種類有限。這些標準物質(zhì)針對的是特定品系。根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特征，檢測方法等，建立了相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，例如由上海交通大學(xué)建立的GMDD(http://gmdd.shgmo.org/)，以及歐盟轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇医⒌腅NGL (http://gmo-crl.jrc.ec. europa .eu/engl/engl. html)。通過比較轉(zhuǎn)基因品系外源基因的信息，發(fā)現(xiàn)它們自身包含1種或幾種特定的啟動子或終止子，并不涵蓋多個啟動子或終止子。玉米中常使用的調(diào)控元件是CaMV35S啟動子(35S)、NOS啟動子(PNOS)、FMV35S啟動子(FMV35S)、PTA 29啟動子(PTA29)、Ubiquitin啟動子(Ubiquitin)、35S終止子(t35S)、nos終止子(tNOS)、E9終止子(tE9)。因此，選擇這些調(diào)控元件構(gòu)建陽性質(zhì)粒，可以更好地用于農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

陽性標準質(zhì)粒分子的構(gòu)建是采用目的外源基因片段進行特異性擴增，重組于質(zhì)粒分子上，轉(zhuǎn)入微生物中進行大量培養(yǎng)。優(yōu)點是質(zhì)粒DNA容易提取且純度高，穩(wěn)定性好，并且一個質(zhì)粒分子中可以包含多個外源目的基因[7]?？梢杂行Ы鉀Q陽性標準品缺乏和陽性標準品制備困難的問題，因此被稱為“金標準物質(zhì)”[8]。

隨著國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因檢測要求的不斷提高，檢測方法開始從定性PCR向定量PCR轉(zhuǎn)變，用質(zhì)粒分子作為定量標準物質(zhì)易于操作?，F(xiàn)階段，國內(nèi)質(zhì)粒分子標準物質(zhì)已經(jīng)在玉米[9-10]和大豆[11]轉(zhuǎn)基因檢測中得到很大的發(fā)展，并且已有質(zhì)粒分子標準物質(zhì)(MON810)申請了有證標準物質(zhì)[12]。但是這些研究是針對一種轉(zhuǎn)化體或一類作物，而在沒有標準物質(zhì)的經(jīng)濟作物、蔬菜、未知材料的檢測時，需要通用型標準物質(zhì)。因此，本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因品種調(diào)控基因的特性，將多個啟動子和終止子整合到質(zhì)粒分子中，構(gòu)建標準質(zhì)粒分子，用于大多數(shù)已經(jīng)批準的轉(zhuǎn)基因作物的檢測和監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 植物樣品與試劑

TaqDNA聚合酶購自Promega生物技術(shù)(美國)有限公司，植物基因組提取試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA marker、dNTPs、pMD-19T購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。大腸桿菌DH5a菌株本實驗室保存。轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS 40-3-2、MON87705、MON89788和A5547-127，轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt11、MON810、Bt176、NK603和TC1507，轉(zhuǎn)基因油菜品系GT73、MS1、RF1和Oxy235，購于美國AOCS公司和上海佑隆生物有限公司。轉(zhuǎn)基因水稻KF6和TT51-1由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心提供。

1.2 質(zhì)粒pMD-RG的設(shè)計

針對國內(nèi)外檢測標準中通用元件基因，構(gòu)建含有一批啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子CaMV35S、玄參花葉病毒35S啟動子FMV35S、煙草花藥組織特異基因TA29啟動子 PTA29、玉米泛素蛋白基因啟動子Ubiquitin、胭脂堿合成酶基因NOS的啟動子PNOS)和終止子(花椰菜花葉病毒的35S終止子t35S、胭脂堿合成酶基因NOS終止子tNOS、豌豆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶E9基因終止子tE9)的多靶標調(diào)控原件標準質(zhì)粒分子，命名為pMD-RG。設(shè)計的質(zhì)粒圖譜及大小見圖1。

1、2、3、4、5分別代表啟動子CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS，6、7、8分別代表終止子t35S、tNOS、tE9。圖1 重疊PCR法構(gòu)建標準質(zhì)粒的示意圖Fig.1 Diagram of standard plasmid constructed by overlapping PCR

1.3 質(zhì)粒pMD-RG的構(gòu)建

根據(jù)CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9的相關(guān)序列信息以及國家標準中使用的引物序列，添加合適的引物互補接頭(表1),利用重組PCR技術(shù)將相鄰片段連接起來，構(gòu)建示意圖見圖1。首先用引物35S-F/35S-FMV35S-R擴增CaMV35S啟動子，用引物FMV35S-F/FMV35S-PTA29-R擴增FMV35S啟動子，將兩部分擴增產(chǎn)物作為模板，用引物35S-F/FMV35S-PTA29-R進行重組PCR，從而將CaMV35S啟動子和FMV35S啟動子2個片段連接在一起，以CaMV35S+FMV35S表示；同樣的方法獲得PTA29+Ubiquitin、PNOS+t35S和tNOS+tE9。再以CaMV35S+FMV35S和PTA29+Ubiquitin擴增產(chǎn)物為模板，用引物35S-F/Ubiquitin-PNOS-R進行重組PCR擴增，獲得CaMV35S+FMV35S+PTA29 +Ubiquitin片段；以PNOS+t35S和tNOS +tE9的擴增產(chǎn)物為模板，利用引物PNOS-F/tE9-R 進行重組 PCR 擴增，獲得PNOS+t35S +tNOS+tE9,最后以CaMV35S+FMV35S +PTA29+Ubiquitin和PNOS+t35S+tNOS+tE9的擴增產(chǎn)物為模板，利用引物35S-F/tE9-R進行重組PCR擴增，獲得CaMV35S+FMV35S+ PTA29+Ubiquitin +PNOS+t35S +tNOS+ tE9的整體序列，用于質(zhì)粒分子調(diào)控元件的構(gòu)建。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a中，挑選單克隆在LB培養(yǎng)基(含有Amp)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件200 r/min，16 h。提取質(zhì)粒進行驗證。

表1重組PCR引物

Table1OverlappingPCRprimers

啟動子和終止子 引物名稱 引物序列(5'→3') 擴增片段大小(bp)CaMV35S35S-FGCTCCTACAAATGCCATCATTGC19535S-FMV35S-RggtggatgtcttGATAGTGGGATT GTGCGTCATCCCFMV35SFMV35S-FAAGACATCCACCGAAGACTTA210FMV35S-PTA29-RccacccaccttaAGGACAGCTCTTTTCCACGTTPTA29PTA29-FTAAGGTGGGTGGCTGGACTA266PTA29-Ubiquitin-RcttgccagtgttACTTGCACCACAAGGGCATAUbiquitinUbiquitin-FAACACTGGCAAGTTAGCAAT314Ubiquitin-PNOS-RacgtaaaacggcCCGTAATAAATAGACACCCPNOSPNOS-FGCCGTTTTACGTTTGGAACTG183PNOS-t35S-RcatgagcgaaacTTATGGAACGTCAGTGGAGCt35St35S-FGTTTCGCTCATGTGTTGAGC121t35ST-tNOS-RgcaacaggattcGGGGATCTGGATTTTAGTACTGtNOStNOS-FGAATCCTGTTGCCGGTCTTG180tNOS-tE9-RccaatgccataaTTATCCTAGTTTGCGCGCTAtE9tE9-FTTATGGCATTGGGAAAACTGT273tE9-RATATATTCTTCGGTCATTAGAGGC

引物中小寫部分為接頭。

1.4 重疊PCR擴增

用添加互補接頭的特異性引物分別擴增出含有接頭的基因片段。PCR體系：10×PCR buffer 2.500 μl，Mg2+2.500 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.000 μl，上游引物 0.750 μl，下游引物 0.750 μl，DNA模板(50～100 ng)1.250 μl，TaqDNA聚合酶0.125 μl，補水至25.000 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的正確片段條帶進行切膠回收。

將含有互補接頭的膠回收產(chǎn)物進行連接，進行重疊PCR。PCR體系：10×PCR buffer 2.50 μl，Mg2+2.50 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.00 μl，DNA模板各1.00 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，補水至25.00 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火10 min，72 ℃延伸3 min，循環(huán)15次；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系中添加第1段基因的正向引物和第2段基因的反向引物，其他反應(yīng)體系和條件不變。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的大小正確的條帶進行切膠回收。膠回收產(chǎn)物即為2個片段的連接產(chǎn)物。

1.5 重組片段克隆與驗證

PCR擴增得到的特異性片段與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，涂布含Amp的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落，進行PC擴增驗證和測序驗證。

PCR 擴增驗證：利用表2中不含接頭的引物對標準質(zhì)粒pMD-RG的外源插入基因進行驗證，檢驗所構(gòu)建的質(zhì)粒是否能夠擴增預(yù)期的所有片段。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同方法1.4中含有接頭的基因片段的擴增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，比較目的基因擴增產(chǎn)物同預(yù)期片段大小是否一致。

測序驗證：由生工生物工程(上海) 股份有限公司完成質(zhì)粒分子的測序驗證。測序結(jié)果分別同NCBI進行blast，驗證載體中序列的準確性。

1.6 pMD-RG質(zhì)粒分子檢驗及應(yīng)用

按照標準物質(zhì)的國家標準JJG 1006-1994[13]，對構(gòu)建的標準質(zhì)粒pMD-RG進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗。

均勻性檢驗：取樣方法按國家標準JJG 1006-1994 技術(shù)規(guī)范進行。將稀釋至1 μl 1×106拷貝的質(zhì)粒溶液以500 μl分裝至凍存管中，共分裝300 管。從中隨機取10 管，分別標記為 1～10，對各管質(zhì)粒分子中的每個目標片段進行檢測。

穩(wěn)定性檢驗：對質(zhì)粒樣品進行短期穩(wěn)定性比較。將質(zhì)粒溶液稀釋至1 μl 1×106拷貝，以每管50 μl 分裝至0.2 ml的PCR管內(nèi)，分別將樣品置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃存放，在第1 d、第7 d、第14 d、第21 d和第28 d時對質(zhì)粒樣品進行PCR檢測，對樣品的穩(wěn)定性進行比較。

pMD-RG質(zhì)粒分子的應(yīng)用：分別以構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pMD-RG和基質(zhì)標準品中提取的DNA為模板，進行PCR擴增，比較質(zhì)粒分子中各調(diào)控元件的擴增和穩(wěn)定性與基質(zhì)標準品是否一致。PCR體系及擴增程序同方法1.4中含有接頭的基因片段的擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 重疊PCR擴增獲得的啟動子和終止子重組片段

根據(jù)圖1所示，進行載體構(gòu)建。利用表1中各基因的上游和帶有互補接頭的下游引物分別擴增，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖2。正確的片段切膠回收后，將含有互補接頭的膠回收產(chǎn)物進行連接，以此作為模板進行重疊PCR，電泳后切膠回收獲得連接產(chǎn)物，即為2個片段的連接產(chǎn)物(圖2)。

確定條帶大小正確后，進行切膠回收，再將2個片段連接起來。分別為CaMV35SS+ FMV35S(405 bp)、PTA 29 +Ubiquitin(580 bp)、PNOS +t35S(304 bp)、tNOS +tE9(453 bp)(圖3A、圖3B、圖3C、圖3D)。之后再拼接上述片段，即CaMV35S +FMV35S +PTA 29 +Ubiquitin(985 bp)和PNOS +t35S+tNOS+tE9(757 bp)(圖3E、圖3F)。最后，將2個大片段整合起來，得到完整的8個調(diào)控元件的片斷(1 742 bp)(圖3G)。

2.2 轉(zhuǎn)基因篩查陽性質(zhì)粒的鑒定

利用分子克隆方法，將重疊PCR擴增獲得的重組片段連接到質(zhì)粒載體pMD-19T上，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因篩查陽性質(zhì)粒pMD-RG。對重組質(zhì)粒進行鑒定和驗證。

通過紫外分光光度計測量DNA 純度及質(zhì)量濃度，測定其在260 nm、280 nm處的紫外光吸收值，將質(zhì)量濃度稀釋為50 ng/μl。測定結(jié)果表明，260 nm與280 nm處的吸光值比值在1.80至2.00 之間，260 nm與230 nm處的吸光值比值在2.0至2.3之間，說明DNA 純度符合質(zhì)粒標準分子要求。

M：DL 2000 bp marker；1：陰性對照；2～5：模板為含有目標基因的轉(zhuǎn)基因材料；啟動子CaMV35S和終止子tNOS以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2為模板；啟動子FMV35S、終止子tE9以轉(zhuǎn)基因油菜GT73為模板；啟動子PTA29以轉(zhuǎn)基因油菜MS1為模板；啟動子PNOS以轉(zhuǎn)基因油菜RF1為模板；終止子t35S以轉(zhuǎn)基因玉米Bt176為模板；啟動子Ubiquitin以轉(zhuǎn)基因玉米MON810為模板。圖2 轉(zhuǎn)基因作物中啟動子和終止子的擴增Fig.2 Amplification of promoter and terminator of transgenic crops

M：DL 2000 bp marker；1：陰性對照；2～5：連接后的片段。A:CaMV35S+FMV35S;B:PTA29+Ubiquitin;C:PNOS+t35S;D:tNOS+tE9;E:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin;F:PNOS+t35S+tNOS+tE9;G:CaMV35S+FMV35S+PTA29+Ubiquitin+PNOS+t35S+tNOS+tE9。圖3 啟動子和終止子的連接片段Fig.3 The segment connection of promoters and terminators

利用表1中各基因的上、下游引物，對標準質(zhì)粒pMD-RG的外源插入片段進行驗證[14-15]。結(jié)果顯示，擴增條帶片段大小與預(yù)期片段大小一致(圖4)，各片段大小分別為CaMV35S 195 bp、FMV35S 210 bp、PTA29 266 bp、Ubiquitin 314 bp、PNOS 183 bp、t35S 121 bp、tNOS 180 bp、tE9 273 bp，表明載體構(gòu)建成功。同時對質(zhì)粒分子進行測序驗證(圖4)。BLAST分析結(jié)果表明：pMD-RG克隆序列長1 742 bp，與實際堿基序列完全吻合。

a圖中， M為DL 2000 bp marker，NC為空白對照，1～8依次為CaMV35S、FMV35S、PTA29、Ubiquitin、PNOS、t35S、tNOS、tE9；b圖中，下劃線表示質(zhì)粒標準分子構(gòu)建中所用的引物位置。圖4 標準質(zhì)粒pMD-RG的PCR擴增驗證(a)和測序驗證(b)Fig.4 PCR amplification and sequencing validation of standard plasmid pMD-RG

2.3 pMD-RG質(zhì)粒分子的均勻性和穩(wěn)定性

將pMD-RG質(zhì)粒標準分子同一稀釋到1 μl 1×106拷貝，分裝，隨機抽取其中的10管進行均勻性檢驗。PCR擴增結(jié)果(圖5)顯示10管質(zhì)粒標準分子都擴增出對應(yīng)的8個調(diào)控基因片段，說明質(zhì)粒標準分子各管間均勻性良好。

M：DL 2000 bp marker；1～10：隨機抽取的10管質(zhì)粒分子。圖5 pMD-RG質(zhì)粒標準分子均勻性驗證Fig.5 Verification of uniformity of standard plasmid molecules of pMD-RG

對pMD-RG質(zhì)粒分子進行短期內(nèi)穩(wěn)定性檢驗。PCR擴增結(jié)果(圖6)表明，pMD-RG質(zhì)粒分別在25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃溫度下存放1 d、7 d、14 d、21 d、28 d，擴增結(jié)果均很好。說明短期內(nèi)pMD-RG標準質(zhì)粒穩(wěn)定性好，擴增結(jié)果可靠。

2.4 pMD-RG質(zhì)粒分子的應(yīng)用分析

對構(gòu)建的質(zhì)粒pMD-RG進行PCR擴增鑒定。從表2可以看出，質(zhì)粒pMD-RG中各調(diào)控元件均得到了擴增并與基質(zhì)標準品的結(jié)果一致，證明構(gòu)建的含調(diào)控元件的篩查質(zhì)粒分子pMD-RG可以作為轉(zhuǎn)基因作物檢測的陽性標準品用于轉(zhuǎn)基因成分檢測。

表2轉(zhuǎn)基因作物篩查質(zhì)粒pMD-RG的PCR擴增鑒定

Table2PCRidentificationofscreeningplasmidpMD-RGfortransgeniccrop

轉(zhuǎn)基因作物品系CaMV35SFMV35SPTA29UbiquitinPNOS t35StNOStE9Bt11+NN+NN+NBt176+NN+N+NNMON810+NN+NNNNNK603+NN+NN+NTC1507+NN+N+NNA5547-127+NNNN+NNGT73N+NNNNN+TT51-1NNNNNN+NKF6+NNNN++NMS1NN+N+N+NRF1NN+N+N+NGTS40-3-2+NNNNN+NMON89788NNNNNNN+OXY235+NNNNN+N

+:檢測出相應(yīng)條帶;N:沒有檢測出。

3 討 論

轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在逐年擴大。在中國，每年都有轉(zhuǎn)基因品系獲得進口證書，2017年農(nóng)業(yè)部發(fā)布轉(zhuǎn)基因生物安全證書(進口)清單，批準孟山都、拜耳、先正達等公司的16個轉(zhuǎn)基因生物安全證書(進口)，涉及的轉(zhuǎn)基因生物為大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜，用途皆為“加工原料”[16]。截至目前，中國進口的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品擴大到46種，對這些獲得進口證書的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管比較嚴格。然而，對進口產(chǎn)品中混雜的非法進口的轉(zhuǎn)基因品種或?qū)嶒炇耶a(chǎn)品擴散的監(jiān)管更為重要。對于未知產(chǎn)品的檢測，當前采用的主要方法是通用元件基因檢測，之后對轉(zhuǎn)化體品系進行分析。在檢測過程中，陽性標準物質(zhì)是檢測過程中的標尺，然而由于來源于植物原材料本身的標準物質(zhì)的制備過程非常復(fù)雜，需要精度很高的設(shè)備，生產(chǎn)成本較高，保存環(huán)境要求高等因素，獲得所有不同轉(zhuǎn)基因植物的標準樣品難度比較大[17]。而標準質(zhì)粒分子是一種重組質(zhì)粒分子，根據(jù)需要可組合轉(zhuǎn)基因作物的內(nèi)源基因，待檢測的外源基因，轉(zhuǎn)化體特異性片段，該物種特異性片段，也可插入多組外源基因，并且制備上操作簡便，生產(chǎn)成本低，容易獲得高純度質(zhì)粒標準分子DNA樣品[18]。因此含有通用元件的質(zhì)粒作為陽性對照在檢測中使用比較便捷。

在質(zhì)粒構(gòu)建過程中，如果選擇常規(guī)的質(zhì)粒載體構(gòu)建方法，一般利用酶切位點進行重組克隆，而有時酶切的選擇和位點引入存在一定難度，同時在構(gòu)建過程中要進行多次酶切和連接操作，這使得構(gòu)建過程繁雜而且構(gòu)建成本也較高[19]。本研究中選擇的重疊PCR技術(shù)比較方便快速。重疊PCR最初是用于基因定點突變中[20]，后來被擴展應(yīng)用到2個片段的拼接[21]。該技術(shù)也曾在其他質(zhì)粒分子的構(gòu)建中使用，設(shè)計的引物中有18～25個堿基重疊，重疊序列能將相鄰的8個目標DNA片段連接[22]。本研究將8個調(diào)控元件單獨擴增后，利用重疊PCR技術(shù)將這些調(diào)控元件片段融合在一起，進行克隆，構(gòu)建了含有8個調(diào)控元件的質(zhì)粒載體，相對于引入酶切位點的重組克隆，該技術(shù)更便捷快速。

本研究構(gòu)建的含有調(diào)控元件的標準質(zhì)粒均勻性一致，短期穩(wěn)定性好。已構(gòu)建好的標準質(zhì)粒分子可以在低溫環(huán)境下(4 ℃、-20 ℃、-70 ℃)保存3個月，對檢測結(jié)果沒有影響[23-24]。用標準質(zhì)粒作為標準物質(zhì)，可以避免在檢測過程中陽性物質(zhì)的多次提取，減少陽性物質(zhì)對實驗室的污染。通過分析國外已批準商業(yè)化和國內(nèi)處于環(huán)境釋放階段材料的插入元件信息，以及國內(nèi)檢測標準的需要，選擇轉(zhuǎn)化體中通用調(diào)控元件構(gòu)建篩查質(zhì)粒，構(gòu)建的篩查質(zhì)?？梢愿采w絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體，可作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測和監(jiān)管的對照標準物質(zhì)。