朱 榮 ， 宿玲恰 ， 吳 敬 *

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

環(huán)糊精 （cyclodextrin，CD）是葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀糊精，常見的是聚合度為 6、7、8 的環(huán)狀糊精，即 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，而大元環(huán)糊精（cycloamylose，CA）是指聚合度在9至幾百的環(huán)狀糊精[1]。大元環(huán)糊精具有大小不一、結(jié)構(gòu)各異的疏水空穴，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在不穩(wěn)定性和多變性，可隨客體分子、溶劑的變化發(fā)生改變，可用于包合成分復(fù)雜、分子大小各異的混合物[3]。大元環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)具有多樣性，其固體狀態(tài)和在溶劑里的狀態(tài)可能具有不同的立體結(jié)構(gòu)。它對蛋白質(zhì)有重折疊作用，能促使變性的酶重新正確折疊，并恢復(fù)其活性[3]。在食品領(lǐng)域，大元環(huán)糊精可作為食品的回生抑制劑、風(fēng)味物質(zhì)的緩釋劑。在化學(xué)工業(yè)中，其高水溶性、低黏度等特性使其能和乙醇、去垢劑等分子更好地形成包合物。在醫(yī)藥領(lǐng)域，大元環(huán)糊精可以與布洛芬等藥物發(fā)生相互作用，穩(wěn)定藥物。因此，大元環(huán)糊精在生物、食品、化學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。

4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶 （4-α-glucanotransferase，EC 2.4.1.25）是一種多功能酶，具有環(huán)化、偶合、歧化和水解四種活力，它通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用（環(huán)化反應(yīng)）生產(chǎn)大元環(huán)糊精[4]。該酶可分為兩大類，一類是來源于微生物的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶，如釀酒酵母中的糖原脫支酶[5]，芽孢桿菌中的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[6]以及麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶[4]。另一類是來源于植物的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶，如馬鈴薯組織中的D-酶[6]。國外對4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的研究主要集中在克隆表達(dá)新的基因，并研究其酶學(xué)性質(zhì)和晶體結(jié)構(gòu)[8]。Terada等在E.coli中成功克隆表達(dá)了來自Thermus aquaticusATCC33923的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因（MalQ基因），將獲得的酶作用于直鏈淀粉，證實(shí)了該酶能催化分子內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移而生成大元環(huán)糊精[4]，并研究了該基因中與水解活性相關(guān)的位點(diǎn)，探究其對環(huán)化活性及轉(zhuǎn)化率的影響[8]。而國內(nèi)的研究工作起步比較晚，王興水教授等已在大腸桿菌中克隆表達(dá)來自于Streptomyces ssp.ST66的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因，并優(yōu)化了其產(chǎn)酶條件[13]。目前大元環(huán)糊精的生產(chǎn)仍處于利用直鏈淀粉為底物的實(shí)驗(yàn)室少量制備階段，而直鏈淀粉價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)及其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。許燕以1 g/dL高直鏈玉米淀粉為底物，經(jīng)異淀粉酶脫支預(yù)處理后，在二甲亞砜反應(yīng)體系中，用Thermus aquaticusATCC 33923來源的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶與脫支后的底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將大元環(huán)糊精的最大轉(zhuǎn)化率由24.55%提高到45.58%[14]。由于高直鏈玉米淀粉價(jià)格相對于普通淀粉較貴，研究出以天然淀粉原料為底物制備大環(huán)糊精，能大大降低生產(chǎn)成本，具有重要實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。作者以普通馬鈴薯淀粉為底物，經(jīng)過異淀粉酶脫支預(yù)處理，利用Aquifex aeolicus來源的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶制備大元環(huán)糊精，顯著提高了轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

超嗜熱菌 （Aquifex aeolicus）基因組、E.coliJM109、E.coliBL21（DE3）：為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T?Simple vector：購自TaKaRa公司；表達(dá)載體 pET-24a（+）：購自 Novagen公司。

1.2 培養(yǎng)基

LB 種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化鈉 10；卡那霉素（Kan）終質(zhì)量濃度為 30 μg/mL。

TB 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉 24，蛋白胨 12，磷酸二氫鉀2.31，磷酸氫二鉀12.54，甘油5；卡那霉素（Kan）終質(zhì)量濃度為 30 μg/mL。

1.3 試劑與儀器

異淀粉酶、普魯蘭酶粗酶液：由作者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存，酶活力分別為3 000、1 200 U/mL。大元環(huán)糊精標(biāo)樣、根霉Rhizopus sp.來源糖化酶Amyloglucosidase：購買于sigma公司，酶活力約為36 U/mg。

酵母粉、蛋白胨：購自英國Oxoid公司；玉米淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯淀粉：均為市售食品級淀粉；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒：購于天根生化科技有限公司；卡那霉素、氨芐霉素：購于生工生物工程有限公司；PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、核酸限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：購自寶生物工程（大連）公司；其他試劑：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PCR儀、凝膠成像儀和蛋白質(zhì)電泳儀：購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C型核酸電泳儀：購于北京六一儀器廠；細(xì)胞破碎儀：購自浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)：購于日本Shimadzu公司；高效液相色譜儀：購自美國Agilent公司；TSKgel凝膠色譜柱 SuperMultipore PW-N：購自日本TOSOH公司。

1.4 工程菌的構(gòu)建

1.4.1 AaAM基因的克隆 以實(shí)驗(yàn)室保存的Aquifex aeolicus基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，正向和反向引物序列分別為 5′-GCCGCCATATGAGATTG GCAGGTATTTTA-3′和 5′-GGCCCAAGCTTAAAC TTCTCTTCCGTAAAT-3′，酶切位點(diǎn)分別為Nde I和Hind III，通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因AaAM。

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：蒸餾水（已滅菌）33.5 μL，5×PS Buffer 10 μL，dNTPs 4 μL， 模板 1 μL，正反引物各 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.5 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，55 ℃5 s，72 ℃ 110 s，循環(huán) 30 次，72 ℃ 10 min。

1.4.2 表達(dá)載體pET-24a（+）-AaAM的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物純化后連接至載體pMD18-T?，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在LB瓊脂平板 （含100 μg/mL Amp）上于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取單克隆在LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp）中培養(yǎng)8~10 h，抽提質(zhì)粒得pMD18-T?-AaAM，并雙酶切和測序鑒定。序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。

pMD18-T?-AaAM與表達(dá)達(dá)載體pET-24a（+）分別經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切和膠回收后，用T4連接酶在 16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli JM109，在 LB 瓊脂平板（含 30 μg/mL Kan）上于 37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取單克隆在LB液體培養(yǎng)基（含 30 μg/mL Kan）中培養(yǎng) 8~10 h，抽提質(zhì)粒pET-24a（+）-AaAM并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)入 E.coli BL21（DE3）中，37 ℃培養(yǎng) 8 h，保存菌種，即得到重組基因工程菌E.coli BL21/pET-24a（+）-AaAM。

1.5 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM

將于-80℃保藏的重組菌E.coli BL21/pET-24a（+）-AaAM以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)8 h后，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)2 h后加入0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，降溫至25℃進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，每隔5小時(shí)取樣、離心收集菌體，用50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 6.6）懸浮菌體，超聲破碎后離心得破壁上清液，即為4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM粗酶液。

1.6 4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM活性測定

分別取0.25 mL的底物 （0.5%可溶性淀粉溶液）、0.05 mL的 1 g/dL麥芽糖溶液和 0.6 mL、0.05 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 6.6）于試管中，70℃水浴預(yù)熱10 min。加入0.1 mL稀釋的酶液，振蕩混勻，反應(yīng)10 min，沸水浴15 min終止反應(yīng)[10]。向上述反應(yīng)體系中加入10 mL碘液 （0.2%KI+0.02%I2），混勻，在 620 nm下測量其吸光值。酶活單位定義：在酶活測量體系下，每分鐘降解1 mg/mL淀粉所需的酶量[15]。

1.7 淀粉脫支反應(yīng)

用 0.05 mmol/L、pH 6.6 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制1 g/dL馬鈴薯淀粉溶液70℃加熱糊化10 min；加入一定量的脫支酶，充分混勻后在適宜溫度下于水浴搖床反應(yīng)一段時(shí)間；反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴30 min滅酶。

1.8 大元環(huán)糊精的制備以及含量測定[14]

用 0.05 mmol/L、pH 6.6 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制1 g/dL馬鈴薯淀粉溶液70℃加熱糊化10 min；加入一定量的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM，充分混勻后在70℃水浴搖床中200 r/min反應(yīng)一段時(shí)間；反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴30 min滅酶，在反應(yīng)液中加入50 U/g糖化酶、50 U/g異淀粉酶和50 U/g普魯蘭酶[19]，充分混勻后在40℃水浴搖床中反應(yīng)10 h；反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴30 min滅酶，將反應(yīng)液12 000 r/min離心 10 min，取上清液，經(jīng)過濾膜過濾（0.45 μm）后用HPLC分析。

繪制大元環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取大元環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品， 配制成相應(yīng)的質(zhì)量濃度（0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2 g/dL） 溶液， 經(jīng)過超濾膜過濾（0.45 μm）備用。根據(jù)大元環(huán)糊精質(zhì)量濃度和峰面積之間的關(guān)系得大元環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于后續(xù)制備的大元環(huán)糊精的定量分析。

1.9 HPSEC體積排阻色譜法定量分析大元環(huán)糊精

利用HPSEC體積排阻色譜法測量大元環(huán)糊精的色譜條件是[14]：日立 Hitachi色譜儀，Super Multipore PW-N（6.0 mm × 150 mm）凝膠色譜柱，日立L-2490示差檢測器，流動(dòng)相0.05 mmol/L pH 6.6 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，流速0.3 mL/min；柱溫設(shè)定為50℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌 E.coli BL21/pET-24a （+）-AaAM 的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pET-24a（+）-AaAM 的構(gòu)建 以實(shí)驗(yàn)室保存的Aquifex aeolicus基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得AaAM基因片段，其大小經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證為1.5 kb。將所得基因片段與克隆載體相連得到重組質(zhì)粒pMD18-T?-AaAM，測序獲取基因序列，所得AaAM基因編碼的氨基酸序列與NCBI中Aquifex aeolicus來源的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列同源性100%[16]。將表達(dá)載體pET-24a（+）和重組質(zhì)粒pMD18-T?-AaAM雙酶切、純化回收后連接，轉(zhuǎn)入E.coliJM109，培養(yǎng)重組菌并抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。如圖1所示，在5 300 bp和1 500 bp附近有明顯條帶，條帶大小與預(yù)期相符，表明重組表達(dá)載體pET-24a（+）-AaAM構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pET-24a（+）-AaAM酶切驗(yàn)證Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid pET-24a（+）-AaAM

2.1.2 重組菌E.coliBL21/pET-24a（+）-AaAM 的構(gòu)建及培養(yǎng) 將重組質(zhì)粒pET-24a（+）-AaAM轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coliBL21（DE3），構(gòu)建重組菌E.coliBL21（DE3）/pET-24a（+）-AaAM。 重組菌經(jīng) LB 培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基，并加入IPTG誘導(dǎo)，每隔5小時(shí)取樣離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后得粗酶液測定酶活，酶活隨時(shí)間變化的曲線見圖2。隨著時(shí)間的推移，重組4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM酶活不斷增加，誘導(dǎo)27 h達(dá)到最高酶活0.99 U/mL，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間，酶活呈下降趨勢。蛋白質(zhì)電泳SDS-PAGE結(jié)果見圖3。在4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM理論相對分子質(zhì)量60 000處出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)條帶，AaAM在E.coliBL21（DE3）中成功表達(dá)。

圖2 重組菌在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)酶曲線Fig.2 Fermentation process of the recombinant E.coli BL21（DE3） in shake flask

圖3 4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the AaAM

2.2 重組4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶制備大元環(huán)糊精工藝優(yōu)化

2.2.1 4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶加酶量對大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響 4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶是一種多功能型酶，具有環(huán)化、偶合、歧化和水解四種活力，其相互作用與反應(yīng)體系中的加酶量有關(guān)，因此大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率會受加酶量的影響[17]。作者以1 g/dL的馬鈴薯淀粉為底物，用pH 6.6 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對淀粉在70℃加熱糊化10 min，加入不同量的AaAM，加酶量分別為 1、5、10、20、50、80、100 U/g 底物，探究其對大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響。反應(yīng)完成后，加入根霉來源的糖化酶、異淀粉酶、普魯蘭酶處理未反應(yīng)的底物，產(chǎn)物用HPSEC法進(jìn)行定量檢測。如圖4所示，隨著加酶量的增大，大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率也逐漸增大，在加酶量20 U/g底物時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，為14.8%，之后加酶量增加，轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢。分析可能的原因是，加酶量增大，水解和偶合反應(yīng)加劇，已生成的大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物，因此轉(zhuǎn)化率降低。考慮到經(jīng)濟(jì)性因素，選擇加酶量為20 U/g。

圖4 加酶量對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.4Effectofenzymedosageontheenzymaticconversion

2.2.2 不同底物利用不同脫支酶先脫支再加入4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶對大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響 作者以1 g/dL的四種常見淀粉：馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉為底物，并采用50 U/g異淀粉酶、50 U/g普魯蘭酶分別先對淀粉進(jìn)行脫支預(yù)處理，脫支反應(yīng)完成后滅活脫支酶，再加入20 U/g的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM制備大元環(huán)糊精。從圖5可以看出，經(jīng)脫支處理的淀粉底物酶轉(zhuǎn)化效率提高，異淀粉酶脫支預(yù)處理后轉(zhuǎn)化效率優(yōu)于普魯蘭酶。其中以脫支處理后的可溶性淀粉為底物時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到25.8%，而未經(jīng)脫支處理的可溶性淀粉轉(zhuǎn)化率為15.6%，提高了1.65倍；脫支后的馬鈴薯淀粉轉(zhuǎn)化率為23.6%，相對于未經(jīng)脫支處理的可溶性淀粉轉(zhuǎn)化率為14.8%，提高了1.59倍，脫支后的木薯淀粉和玉米淀粉的轉(zhuǎn)化率相對較低，為19%左右。造成這種現(xiàn)象可能的原因是不同淀粉的空間結(jié)構(gòu)以及直鏈和支鏈淀粉的組成比例不同[18]。考慮到馬鈴薯淀粉價(jià)格低廉，為降低生產(chǎn)成本，選擇其作為底物。

2.2.3 初始pH對大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響 pH變化可以影響酶活性中心基團(tuán)的解離程度，進(jìn)而影響酶分子與底物分子的結(jié)合，使轉(zhuǎn)化效率發(fā)生改變。作者用pH 6.6 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對淀粉在70℃加熱糊化10 min，加入50 U/g異淀粉酶脫支預(yù)處理，滅活脫支酶后，用NaOH和稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入 20 U/g 的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM制備大元環(huán)糊精。從圖6可以看出，在pH為4.0時(shí)，大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率只有10.9%，可能是在偏酸性條件下，相當(dāng)一部分酶失活；隨著pH的升高，大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)pH為7.0時(shí)，大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到24.2%，與文獻(xiàn)報(bào)道4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM最適pH 6.6接近[16]；當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率下降。

圖6 反應(yīng)pH對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effect of pH on the enzymatic conversion

2.2.4 反應(yīng)溫度對大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響 溫度對酶的穩(wěn)定性及催化速率有顯著影響，本研究考察了不同溫度對AaAM制備大元環(huán)糊精的影響。脫支后調(diào)節(jié)淀粉溶液pH為7.0，AaAM加酶量為20 U/g，分別在 60、65、70、75、80、85 ℃反應(yīng)制備大元環(huán)糊精，結(jié)果見圖7。在60℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率較低為11.9%，隨著溫度的升高，大環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率逐漸提高；在75℃下，大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值24.8%；溫度繼續(xù)升高，大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率下降，在85°C時(shí)轉(zhuǎn)化率降為19.6%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AaAM最適溫度為90℃，但在此溫度下，轉(zhuǎn)化率降低，這可能是由于溫度較高時(shí)，酶的熱穩(wěn)定性變差[16]。綜合以上因素，選用75℃的作為后續(xù)研究的反應(yīng)溫度。

圖7 反應(yīng)溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of temperature on the enzymatic conversion

2.2.5反應(yīng)時(shí)間對大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響 在利用4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶制備大元環(huán)糊精過程中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，酶反應(yīng)體系內(nèi)的小分子糖類物質(zhì)增加，促進(jìn)了4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶偶合作用而減弱了其環(huán)化活性，使得大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率降低[12]。本研究在脫支后調(diào)節(jié)淀粉溶液pH為7.0，AaAM加酶量為20 U/g，在75℃下反應(yīng)制備大元環(huán)糊精。每隔3小時(shí)取樣測定生成的大元環(huán)糊精產(chǎn)量。在酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)前期，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，大元環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率一直上升至10 h左右達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率24.8%，之后轉(zhuǎn)化率呈明顯下降趨勢，見圖8。為節(jié)約成本，增加生產(chǎn)強(qiáng)度，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)定為10 h。

3 結(jié)語

目前大元環(huán)糊精的制備仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，多以直鏈淀粉為底物，價(jià)格昂貴，并未實(shí)現(xiàn)商品化。關(guān)于利用天然淀粉制備大元環(huán)糊精的研究，許燕等使用經(jīng)異淀粉酶脫支處理的1 g/dL高直鏈玉米淀粉，在二甲亞砜反應(yīng)體系中與Thermus aquaticusATCC 33923來源的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將大元環(huán)糊精的最大轉(zhuǎn)化率由24.55%提高到45.58%[14]。本研究中將來源于超嗜熱菌Aquifex aeolicus的基因AaAM在大腸桿菌中經(jīng)過克隆表達(dá)，成功構(gòu)建了表達(dá)4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM的重組菌E.coliBL21（DE3）/pET-24a（+）-AaAM，搖瓶發(fā)酵酶活最大為0.99 U/mL。作者使用價(jià)格低廉的馬鈴薯淀粉，經(jīng)過優(yōu)化加酶量、與不同脫支酶復(fù)配、優(yōu)化初始pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，在底物質(zhì)量濃度為1 g/dL時(shí)，先經(jīng)過50 U/g底物異淀粉酶脫支預(yù)處理，滅活脫支酶后，調(diào)節(jié)初始pH為7.0，在75℃下加入20 U/g底物的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶AaAM時(shí)，在10 h時(shí)大元環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高24.8%，為大元環(huán)糊精的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。