徐保國(guó)， 魏本喜， 齊文慧， 任曉鋒*， 周存山， 馬海樂(lè)

（1．江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

油菜籽經(jīng)過(guò)物理壓榨和溶劑浸提等方法所得到的油，稱為菜籽毛油。菜籽毛油中含有多種雜質(zhì)，如磷脂、蛋白質(zhì)、糖類、色素、游離脂肪酸等，需要經(jīng)過(guò)一系列精煉工序后才能食用[1]。在油脂的精煉加工過(guò)程中，脫膠是第一個(gè)工序，其主要目的是脫除毛油中的磷脂、糖、蛋白質(zhì)等膠質(zhì)混合物，其中磷脂是這些膠質(zhì)中的主要成分，因此脫膠也被稱為脫磷。

脫膠過(guò)程如果不徹底，會(huì)嚴(yán)重影響油脂后續(xù)精煉工序的正常進(jìn)行，如影響油脂堿煉、導(dǎo)致油脂脫色后色度回升、脫臭工序中的高溫易導(dǎo)致磷脂焦化變黑而加深油脂色澤[2]；此外，在精煉后油脂的儲(chǔ)藏過(guò)程中，磷脂的存在會(huì)造成油脂返色[3]和回味[4]等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)。傳統(tǒng)的脫膠方法包括水化脫膠和酸法脫膠兩大種。水化脫膠可以去除大部分與磷脂相結(jié)合的膠質(zhì)類物質(zhì)，而菜籽毛油中的磷脂分為水化磷脂和非水化磷脂，水化脫膠僅能脫除水化磷脂，而非水化磷脂仍殘留在油脂中，難以滿足精煉的要求；酸法脫膠可以通過(guò)添加一定量的酸，將毛油中與金屬離子結(jié)合的非水化磷脂轉(zhuǎn)化成水化磷脂，再加入適量的水將其去除，酸法脫膠大大降低了脫膠油的磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但是這種方法所達(dá)到的脫膠效果大多數(shù)都不能滿足物理精煉的要求（磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜10 mg/kg）[5-6]。

為了提高脫膠效果，研究人員一直致力于新型脫膠方法的開(kāi)發(fā)，如超臨界CO2脫膠[7]、超濾脫膠[8]和酶法脫膠[9-10]等。其中，酶法脫膠因其反應(yīng)條件溫和、中性油損失少、油脂得率高和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。雖然酶法脫膠有很好的脫膠效果，但脫膠反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)（4.0～6.5 h）[11-12]，因而制約了酶法脫膠在油脂精煉工業(yè)中的應(yīng)用。為了縮短酶法脫膠時(shí)間，提高脫膠效率，將超聲波技術(shù)引入酶法脫膠的過(guò)程當(dāng)中。本團(tuán)隊(duì)的前期研究主要考察了磷脂酶A1和超聲輔助磷脂酶A1對(duì)菜籽油脫膠效果的影響[9]，作者在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，更加系統(tǒng)地研究了多頻超聲輔助磷脂酶A1對(duì)菜籽油的脫膠效果以及脫膠后油的品質(zhì)變化的影響，以期為超聲波在酶法脫膠工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菜籽毛油：江蘇金太陽(yáng)糧油股份有限公司提供，含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（467.32±4.79） mg/kg；磷脂酶A1：杰能科（中國(guó)）酶制劑有限公司，酶活為10 KLU/g。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 多頻超聲波裝置：江蘇大學(xué)研制；氧化穩(wěn)定儀：Rancimat 743，瑞士萬(wàn)通公司；馬弗爐：SX2-4-10-S，上海帥登儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-6000A，上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀：GCMS-QP2010 ULTRA，日本島津公司；離心機(jī)：LD5-2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2.2 主要試劑 檸檬酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、氧化鋅、硫代硫酸鈉、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸聯(lián)氨、甲醇、乙醇、乙酸等藥品和試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

根據(jù)之前的操作步驟[9]，具體如下：稱取100 g菜籽毛油，放入250 mL的錐形瓶中，恒溫水浴加熱到80℃，然后，添加質(zhì)量濃度為40 g/dL的檸檬酸溶液0.13 mL，10 000 r/min均質(zhì)1 min，結(jié)束后在80℃水浴下以500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min，再加入一定量NaOH溶液（4 mol/L），調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值（4.2～5.4），攪拌均勻后，邊攪拌邊加入一定量的去離子水（1%～5%）和磷脂酶 A1（10～150 μL/kg），將錐形瓶置于多頻超聲波發(fā)生裝置上進(jìn)行反應(yīng)，超聲的條件分別為：20、50、20/50、20/35/50 kHz 的不同超聲頻率組合，超聲功率為180 W，超聲的脈沖方式為10 s工作/3 s間隙，設(shè)置溫度為設(shè)定值（20～60℃），待酶法脫膠反應(yīng)到設(shè)定的時(shí)間后 （10～120 min），將菜籽油的溫度升高至90℃，滅酶10 min，在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上層油層，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到脫膠菜籽油。其中對(duì)照組的過(guò)程與上述一致，但不采用超聲波作用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 菜籽油含磷量測(cè)定 根據(jù)GB/T 5537-2008《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測(cè)定》法進(jìn)行。

1.4.2 菜籽油品質(zhì)分析 油脂酸值測(cè)定：采用GB/T 5530-2005法；油脂碘價(jià)測(cè)定：采用GB/T 5532-2008法；油脂色澤測(cè)定：采用GB/T 22460-2008法；油脂過(guò)氧化值測(cè)定：采用GB/T 5538-2005法；油脂氧化穩(wěn)定性的測(cè)定（OSI值）：參照Xu等[13-14]方法進(jìn)行；菜籽油脂肪酸組成測(cè)定：參照文獻(xiàn)[15]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

至少重復(fù)3次試驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 18.0軟件中的Ducan程序進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多頻超聲波輔助磷脂酶對(duì)菜籽油脫膠效果的影響

2.1.1 加酶量對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響磷脂酶A1的添加量對(duì)不同頻率超聲輔助脫除菜籽油中磷脂的效果見(jiàn)圖1。具體反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度40℃，pH 4.8，加水量2%，超聲波功率180 W，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)時(shí)間90 min。

從圖1可以看出，隨著磷脂酶A1添加量的增加，所有處理方式下，菜籽油的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)；且當(dāng)磷脂酶A1的添加量達(dá)到90 μL/kg時(shí)，再繼續(xù)增加酶的添加量，菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降趨勢(shì)變得緩和。此外，圖1還顯示了超聲波作用可顯著提高菜籽油中含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低速率，同時(shí)還可以大大降低菜籽油中含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的幅度。當(dāng)酶用量為90 μL/kg時(shí)，對(duì)照組的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.77 mg/kg，而超聲作用的菜籽油含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低至8 mg/kg以下。這可能是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械效應(yīng)給酶解反應(yīng)體系提供了有效的推動(dòng)力，促進(jìn)了油水兩相的混合，并且超聲波具有較強(qiáng)的乳化[16]和分散作用[17-18]，可以使反應(yīng)體系更為均勻，有效地提高底物與磷脂酶A1的接觸機(jī)率，從而提高酶的反應(yīng)效率。

圖1還顯示了不同超聲頻率作用下菜籽油的脫膠效果，其中，20/50 kHz雙頻組合作用下菜籽油的脫膠效果最好，其次分別為20/30/50 kHz三頻組合、50 kHz和20 kHz。這說(shuō)明了不同的超聲頻率對(duì)菜籽油的酶法脫膠效果有不同的影響，且存在最佳的脫膠頻率。馮若等[19]研究表明，以頻率為fa的超聲波作用于體系，只有那些體系共振頻率fT接近于fa，體系才能對(duì)聲場(chǎng)積極響應(yīng)，聲化學(xué)產(chǎn)額才能達(dá)到最佳。此處，可能是因?yàn)?0/50 kHz雙頻頻率組合更加接近菜籽油酶法反應(yīng)體系的共振頻率，所以相對(duì)其他幾種頻率超聲作用而言，20/50 kHz作用下的脫膠效果更明顯。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響圖2顯示了反應(yīng)時(shí)間對(duì)不同頻率超聲輔助脫除菜籽油中磷脂的效果，具體反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度40℃，pH 4.8，加水量 2%，加酶量 90 μL/kg，超聲波功率180 W，攪拌速度500 r/min。

圖1 加酶量對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菜籽油的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)下降。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，對(duì)照組的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.25 mg/kg，而不同頻率超聲作用下的菜籽油含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降至20 mg/kg以下；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至120 min時(shí)，對(duì)照組的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.44 mg/kg，仍未能滿足菜籽油物理精煉的要求（殘磷量＜10 mg/kg）[5]，而 20/50 kHz 雙頻超聲作用30 min時(shí)，菜籽油的含磷量降至9.83 mg/kg；當(dāng)作用時(shí)間為60 min時(shí)，所有頻率超聲作用下的菜籽油含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降至10 mg/kg以下，且繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間，含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降幅度不明顯。這說(shuō)明了超聲作用可以很大程度上縮短菜籽油脫膠反應(yīng)的時(shí)間，且有效降低了菜籽油的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響Fig.2 Effect of reaction time on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.1.3 體系pH對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響圖3顯示了體系pH值對(duì)不同頻率超聲輔助脫除菜籽油中磷脂的效果。具體反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度40℃，加水量2%，加酶量90 μL/kg，超聲波功率180 W，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)時(shí)間90 min。

在酶與底物反應(yīng)體系中，pH值影響著酶分子活性部位的帶電基團(tuán)與底物的結(jié)合，當(dāng)pH值偏高或偏低時(shí)，酶活性部位的帶電屬性會(huì)產(chǎn)生改變，降低酶與底物的結(jié)合能力，從而影響反應(yīng)體系的酶解效果。由圖3可知，隨著pH值的升高，菜籽油的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為4.8時(shí)，所有處理?xiàng)l件下菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到最低值；其中，對(duì)照組的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.77 mg/kg，20/50 kHz雙頻超聲作用下的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為3.94 mg/kg。

圖3 體系pH值對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響Fig.3 Effect of pH on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響圖4顯示了反應(yīng)體系溫度對(duì)不同頻率超聲輔助脫除菜籽油中磷脂的效果，具體反應(yīng)條件為：pH 4.8，加水量2%，加酶量 90 μL/kg，超聲波功率 180 W，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)時(shí)間90 min。

溫度是影響酶活性的重要因素之一。隨著反應(yīng)體系溫度的升高，菜籽油含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)體系溫度從20℃升高至40℃時(shí)，對(duì)照組菜籽油的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從25.33 mg/kg下降到最低18.77 mg/kg；隨后溫度不斷升高，菜籽油的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)又呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.33 mg/kg。這說(shuō)明了對(duì)照組體系中，磷脂酶A1的最適溫度為40℃，而溫度升至60℃時(shí)，酶活性大大降低，導(dǎo)致含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高。此外，相比較于對(duì)照組，超聲波輔助磷脂酶脫膠可以大大降低菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.1.5 加水量對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響圖5顯示了加水量對(duì)不同頻率超聲輔助脫除菜籽油中磷脂的效果，具體反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度40℃，pH 4.8，加酶量 90 μL/kg，超聲波功率 180 W，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)時(shí)間90 min。

從圖5可以看出，對(duì)照組在3%的加水量下，菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最低，為17.65 mg/kg；而在超聲輔助磷脂酶脫膠的反應(yīng)體系中，最適的加水量為2%，這是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械作用可以提高體系的傳質(zhì)效率，使水的利用變得更加有效。此外，當(dāng)加水量達(dá)到5%時(shí)，菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而升高，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的水分造成了磷脂的乳化，影響了脫膠的效果，同時(shí)也增加了后期實(shí)驗(yàn)中分離的難度[9]。

圖5 加水量對(duì)多頻超聲酶法脫膠效果的影響Fig.5 Effect of water amount on the ultrasound assisted enzymatic degumming efficiency

2.2 多頻超聲波輔助磷脂酶對(duì)脫膠后菜籽油品質(zhì)的影響

2.2.1 脫膠后菜籽油品質(zhì)指標(biāo)的變化 表1顯示了多頻超聲波輔助磷脂酶對(duì)脫膠后菜籽油酸值、碘價(jià)、過(guò)氧化值和氧化穩(wěn)定性等指標(biāo)的影響，具體反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度40℃，pH 4.8，加水量2%，加酶量90 μL/kg，超聲波功率180 W，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)時(shí)間90 min。

由表1可以看出，與原菜籽油樣品相比，經(jīng)過(guò)磷脂酶A1脫膠和超聲輔助磷脂酶A1脫膠處理后，所得菜籽油的酸價(jià)顯著上升（p＜0.05），這可能是因?yàn)橛椭胁糠种舅岣视王ピ诿撃z過(guò)程中被磷脂酶A1水解成游離脂肪酸，導(dǎo)致油脂酸價(jià)上升[20]；相比較于對(duì)照組，超聲輔助磷脂酶A1作用后的菜籽油酸價(jià)均未發(fā)生顯著性變化（p＞0.05）。過(guò)氧化值的變化趨勢(shì)與酸價(jià)類似，脫膠后的菜籽油過(guò)氧化值顯著上升（p＜0.05），且經(jīng)超聲作用后的脫膠油過(guò)氧化值比對(duì)照組略有提升；此外，脫膠后的菜籽油OSI值顯著降低（p＜0.05），且 20/50 kHz 超聲處理組的OSI值顯著低于對(duì)照組（p＜0.05），這說(shuō)明了超聲作用在一定程度上加速了菜籽油的氧化變質(zhì)[5]。除此之外，脫膠后菜籽油的碘價(jià)也顯著降低（p＜0.05）。盡管脫膠后菜籽油的酸值、碘價(jià)和過(guò)氧化值都發(fā)生了顯著變化，但是均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 1536-2004）所規(guī)定的安全范圍內(nèi)。

色澤、氣味和滋味是消費(fèi)者判斷食用油品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。從表1可以看出，菜籽毛油的色澤為黃35和紅7.0，脫膠后菜籽油的色澤為黃28和紅4.0（對(duì)照組），說(shuō)明了脫膠處理后菜籽毛油的色澤變淺；與對(duì)照組相比，超聲輔助處理的菜籽油色澤黃值和紅值都略有下降，達(dá)到國(guó)標(biāo)GB 1536-2004規(guī)定的三級(jí)油的標(biāo)準(zhǔn)。此外，在氣味和滋味方面，脫膠后的菜籽油未產(chǎn)生特殊的氣味和滋味。

表1 多頻超聲波輔助磷脂酶對(duì)脫膠后菜籽油酸值、碘價(jià)、過(guò)氧化值和氧化穩(wěn)定性等指標(biāo)的影響Table 1 Effect of ultrasound assisted enzymatic degumming on the acid values，iodine values，peroxide values and oxidative stability of rapeseed oil

2.2.2 脫膠后菜籽油的脂肪酸組成變化 圖6顯示了多頻超聲波輔助磷脂酶脫膠后菜籽油的脂肪酸組成圖譜，經(jīng)解譜后得到表2。由表2可以看出，與原油樣相比，磷脂酶A1和超聲輔助磷脂酶A1脫膠后的菜籽油中亞麻酸（C18：3）、花生一烯酸（C20：1）和芥酸（C22：1）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，下降幅度分別在 0.9%、0.5%和 2.0%；棕櫚酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）和亞油酸（C18：2）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所上升，上升幅度分別在0.4%、0.5%、2.8%和0.9%。此外，飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和單不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所上升，多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降。綜合分析，對(duì)比原油樣的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，脫膠后的菜籽油各脂肪酸數(shù)值的上升和下降幅度都不明顯，均在3%以內(nèi)；與對(duì)照組相比，超聲輔助處理所得的菜籽油各脂肪酸數(shù)值的上升和下降幅度非常小，說(shuō)明超聲輔助處理對(duì)菜籽油脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不顯著。

圖6 多頻超聲波輔助磷脂酶脫膠后菜籽油的脂肪酸組成圖譜Fig.6 Pictures of fatty acid compositions of rapeseed oil after ultrasound assisted enzymatic degumming

表2 多頻超聲波輔助磷脂酶對(duì)脫膠后菜籽油脂肪酸組成的影響Table 2 Effect of ultrasound assisted enzymatic degumming on the fatty acid compositions of rapeseed oil

3 結(jié) 語(yǔ)

作者研究了多頻超聲波輔助酶法對(duì)菜籽油脫膠效果及其品質(zhì)的影響，通過(guò)與常規(guī)酶法脫膠進(jìn)行對(duì)比，得出如下結(jié)論：

1）超聲波處理能顯著提高磷脂酶A1對(duì)菜籽油的脫膠效率，顯著降低脫膠后菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)；不同的超聲波頻率對(duì)磷脂酶A1的脫膠效果有明顯差異，其中20/50 kHz雙頻處理對(duì)磷脂酶A1脫膠效果最佳；在反應(yīng)溫度40℃、pH 4.8，加水量2%，加酶量90 μL/kg，超聲波功率180 W，攪拌速度500 r/min的條件下，20/50 kHz雙頻處理僅需30 min便可使菜籽油中的含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至安全標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2）與常規(guī)酶法脫膠后菜籽油對(duì)比，超聲波作用后的脫膠菜籽油酸價(jià)和過(guò)氧化值略有上升（但均在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的安全范圍內(nèi)），氧化穩(wěn)定性下降，色澤變淺；在脂肪酸組成上，數(shù)值有所上升和下降，但幅度均不顯著。實(shí)驗(yàn)證明了超聲波在菜籽毛油脫膠的加工當(dāng)中有很好的應(yīng)用前景。