陳鵬程 ， 蘇 欣 ， 鄭 璞 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

琥珀酸是一些厭氧和兼性厭氧微生物代謝途徑的代謝中間體。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物可以發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，但是只有少數(shù)菌種對(duì)琥珀酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率較高。目前研究得較多的產(chǎn)琥珀酸的微生物有：Actinobacillus succinogenes（產(chǎn)琥珀酸放線桿菌）[1]、Anaerobiospirillum succiniciproducens（產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌）[1]、Mannheinia succiniciproducens（曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌）[1-2]和基因工程Escherichia coli（大腸桿菌）[1，3-4]。此外，有些霉菌和乳酸菌也能產(chǎn)琥珀酸[5]。在種類繁多的產(chǎn)琥珀酸微生物中，從瘤胃中分離的Actinobacillus succinogenes在厭氧環(huán)境中可以利用果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等廣泛的碳源進(jìn)行發(fā)酵，且具有產(chǎn)酸能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因而受到廣泛關(guān)注[6-8]。由于琥珀酸廣泛的應(yīng)用范圍使得市場(chǎng)對(duì)其一直有較大的需求量，而生物發(fā)酵法生產(chǎn)污染小且符合綠色生產(chǎn)的理念，因此，有效利用微生物生產(chǎn)琥珀酸具有重要研究意義。

作者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到一株高產(chǎn)琥珀酸的菌株Actinobacillus succinogenesF3-ZK，最高產(chǎn)酸量為95.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為71%。但因前期培養(yǎng)菌體花費(fèi)高且菌體無(wú)法回收利用，并且和大多數(shù)有機(jī)酸發(fā)酵過(guò)程一樣，琥珀酸的積累會(huì)對(duì)菌體的生物活性和代謝途徑產(chǎn)生抑制作用，從而影響菌株生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸過(guò)程，降低發(fā)酵法生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期采用游離菌體對(duì)琥珀酸放線桿菌進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，由于菌體生長(zhǎng)速度慢，培養(yǎng)基中菌濃不高，適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程極易染菌。研究發(fā)現(xiàn)，纖維床的運(yùn)用能夠提高琥珀酸的生產(chǎn)效率，且具有良好的運(yùn)行穩(wěn)定性，進(jìn)一步觀察到菌體在纖維表面形成生物膜，推測(cè)生物膜的菌體富集作用提高了菌體的耐受性[9]。為了提高Actinobacillus succinogenes富集量，降低適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中的染菌可能性，作者首次使用黏膠微米纖維膜進(jìn)行Actinobacillus succinogenes的吸附固定，借助其比表面積大的優(yōu)勢(shì)提高菌體負(fù)載率，并篩選合適種類的載體材料構(gòu)建纖維床反應(yīng)器，通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化策略提高Actinobacillus succinogenes對(duì)產(chǎn)物琥珀酸鈉的耐受性

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與纖維膜載體 琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesF3-ZK：作者所在實(shí)驗(yàn)室自主篩選誘變得到，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCCNO：M2012036）；黏膠纖維膜載體：浙江省紡織測(cè)試研究院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 一級(jí)種子液培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 （TSB）32.3，酵母膏5；115℃、20 min高壓蒸汽滅菌。

二級(jí)種子液培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏10，無(wú)水葡萄糖 10，NaH2PO4·2H2O 10，K2HPO4·3H2O 20；115 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米漿 25，無(wú)水葡萄 50，蛋氨 酸 0.1，NaH2PO4·2H2O 2.5，K2HPO4·3H2O 2.5，MgCl2·6H2O 0.2，CaCl20.2， 一水谷氨酸鈉 1，Na2S 0.1，糖蜜5；用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至6.0~6.5，121℃、20 min高壓蒸汽滅菌。

TSB 平板（g/L）：TSB 32.3，酵母膏 5，瓊脂粉 16；115℃、20 min高壓蒸汽滅菌。

紫外誘變篩選平板（g/L）：TSB 32.3，酵母膏 5，瓊脂粉16，丁二酸鈉 60~80；115℃、20 min高壓蒸汽滅菌。

1.1.3 試劑 TSB：購(gòu)自宜興永信生物有限公司；酵母膏：購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；其他試劑：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法 一級(jí)種子培養(yǎng)：從-40℃的冰箱中取出保有Actinobacillus succinogenes的甘油管，以4%的接種體積分?jǐn)?shù)接入裝有25 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基的100 mL三角燒瓶中 ，用1 mol/L的NaHCO3溶液（用孔徑為0.22 μm的薄膜過(guò)濾除菌）調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下靜置培養(yǎng)12 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子液種子以4%的接種體積分?jǐn)?shù)接入裝有25 mL二級(jí)種子培養(yǎng)基的100 mL三角燒瓶中，用1 mol/L的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下靜置培養(yǎng)6 h。

1.2.2 載體用量的確定 將黏膠纖維膜剪成表面積與培養(yǎng)液體積比分別為 0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1（cm2∶cm3） 大小，滅菌后用放入已培養(yǎng) 5.5 h 的二級(jí)種子培養(yǎng)液中吸附0.5 h。隨后取出放入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的100 mL三角燒瓶中，加入1 g MgCO3調(diào)節(jié)pH 至6.0~6.5，在37℃、充滿 CO2氣體的條件下發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)培養(yǎng)液OD值，并測(cè)量發(fā)酵液pH值；用HPLC法檢測(cè)琥珀酸質(zhì)量濃度和殘?zhí)琴|(zhì)量濃度以驗(yàn)證載體吸附菌體發(fā)酵性能。

1.2.3 適應(yīng)性進(jìn)化條件的確定 配置丁二酸鈉質(zhì)量濃度分別為 0、20、40、50、60、65、70、80 g/L 的一級(jí)種子培養(yǎng)基，吸取甘油管中保存的活化菌種1 mL于裝有25 mL一級(jí)種子培養(yǎng)液的100 mL三角燒瓶中，加入1 mol/L的NaHCO3溶液 （用孔徑為0.22 μm的薄膜過(guò)濾除菌）調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下，靜置培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結(jié)束后用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)培養(yǎng)液OD值，并測(cè)量培養(yǎng)液pH值，確定菌種生長(zhǎng)情況。確定適應(yīng)性進(jìn)化最適丁二酸鈉質(zhì)量濃度后再接入相應(yīng)鹽濃度的一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后每3小時(shí)測(cè)一次OD值，驗(yàn)證菌種生長(zhǎng)穩(wěn)定性。

1.2.4 耐鹽性適應(yīng)性進(jìn)化 確定適應(yīng)性進(jìn)化最適宜的鹽濃度后配置相應(yīng)濃度的一級(jí)種子培養(yǎng)基。取1 mL甘油管中保存菌種接種到裝有25 mL最適鹽濃度的一級(jí)種子培養(yǎng)液的100 mL三角燒瓶中，加入1 mol/L的NaHCO3溶液（用孔徑為0.22 μm的薄膜過(guò)濾除菌）調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下靜置培養(yǎng)11.5 h后，用黏膠纖維膜吸附0.5 h，隨后轉(zhuǎn)接至下一個(gè)含鹽的一級(jí)種子培養(yǎng)基中傳代。傳代指的是將固定有琥珀酸放線桿菌的載體轉(zhuǎn)接至下一個(gè)含有琥珀酸鈉的一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時(shí)間固定為12 h，培養(yǎng)結(jié)束后再取出載體材料轉(zhuǎn)接至下一培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代。每次轉(zhuǎn)接完成之后用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)上一培養(yǎng)液OD值，測(cè)量培養(yǎng)液pH值，確定菌種生長(zhǎng)情況。此后重復(fù)該操作連續(xù)傳代，每組兩個(gè)平行樣。

1.2.5 紫外誘變方法 取1 mL甘油管中保存的菌種接種到裝有25 mL一級(jí)種子培養(yǎng)液的100 mL三角燒瓶中，加入1 mol/L的NaHCO3溶液（用孔徑為0.22 μm的薄膜過(guò)濾除菌）調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下靜置培養(yǎng)6 h，此時(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。吸取對(duì)數(shù)期菌液5 mL于直徑9 cm培養(yǎng)皿中，放入攪拌子，用15 W、波長(zhǎng)為254 nm的紫外燈在距離培養(yǎng)皿 30 cm處照射20 s[32]之后再接入裝有25 mL一級(jí)種子培養(yǎng)液100 mL三角燒瓶中，加入1 mol/L的NaHCO3溶液 （用孔徑為0.22 μm的薄膜過(guò)濾除菌）調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下靜置后培養(yǎng)12 h，此過(guò)程注意避光操作。

吸取0.5 mL后培養(yǎng)液于裝有4.5 mL生理鹽水的 10 mL EP 管中， 再依次稀釋到 10-5、10-6、10-7，取100 μL涂布于篩選平板上，在37℃、充滿CO2氣體的條件下靜置培養(yǎng)3~5 d。

1.2.6 菌株發(fā)酵性能驗(yàn)證 搖瓶發(fā)酵：取1 mL甘油管中保存的菌種培養(yǎng)至二級(jí)種子，再取二級(jí)種子液種子以4%的接種體積分?jǐn)?shù)接入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的100 mL三角燒瓶中，加入1 g MgCO3調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5，在37℃、充滿CO2氣體的條件下，靜置培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)培養(yǎng)液OD值，并測(cè)量發(fā)酵液pH值；用HPLC法檢測(cè)琥珀酸質(zhì)量濃度和殘?zhí)琴|(zhì)量濃度以驗(yàn)證菌種發(fā)酵性能。

發(fā)酵罐發(fā)酵：取甘油管中保存的菌種培養(yǎng)至二級(jí)種子，再將二級(jí)種子液種子以4%的接種體積分?jǐn)?shù)接入裝有1.5 L初糖質(zhì)量濃度為50 g/L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，37℃、攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min、用1 mol/L的NaHCO3溶液控制pH值在6.0~6.5發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中每隔3~4小時(shí)取樣測(cè)定葡萄糖、OD660值，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于10 g/L時(shí)一次性加入高質(zhì)量濃度的葡萄糖使得發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L左右，待殘?zhí)琴|(zhì)量濃度再一次降低為10 g/L以下時(shí)，從菌體生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酸情況考慮是否繼續(xù)采取補(bǔ)料操作。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液排出，清洗發(fā)酵罐。

1.2.7 測(cè)試方法 培養(yǎng)液中游離菌體量以O(shè)D660值表示，具體是吸取1 mL菌液于比色管中，加入適量濃鹽酸溶解其中碳酸鎂等不溶物，以去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)量發(fā)酵液OD值。菌體OD660值與菌體干重的兌換公式為：1 OD660=0.51 g/L菌體量。

用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖、琥珀酸、乳酸及乙酸的質(zhì)量濃度。采用Waters高效液相色譜儀，色譜柱型號(hào)為Carbomix H-NP10，柱溫55℃，Waters 2414示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)溫度35℃，流動(dòng)相為 3.3 mmol/L H2SO4，流速 0.5 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，單個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間20 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 適應(yīng)性進(jìn)化載體用量確定

用不同用量的粘膠載體吸附二級(jí)種子進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?，當(dāng)載體表面積與發(fā)酵液體積比為 1.0∶1 cm2∶cm3和 1.5∶1 cm2∶cm3時(shí)， 琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率相差不大，考慮到節(jié)省載體用量以增強(qiáng)菌體富集的效果，確定載體用量為載體表面積與發(fā)酵液體積比為 1.0∶1 cm2∶cm3。

表1 不同載體用量（載體表面積與發(fā)酵液體積比，cm2∶cm3）對(duì)琥珀酸生產(chǎn)的影響Table 1 Effects of supports usage（ratio of support surface area to fermentation medium volume，cm2∶cm3）on succinic acid production

2.2 適應(yīng)性進(jìn)化初始鹽質(zhì)量濃度的選擇

分別用含不同琥珀酸鈉質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)Actinobacillus succinogenes，其生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。當(dāng)琥珀酸鈉質(zhì)量濃度升高到60 g/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制，故考慮選擇40 g/L或50 g/L作為菌株耐鹽適應(yīng)性的初始質(zhì)量濃度。用分別含琥珀酸鈉40、50 g/L的一級(jí)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)Actinobacillus succinogenes，培養(yǎng)12 h之后每隔3小時(shí)測(cè)一次OD660值，驗(yàn)證菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?，菌株在兩個(gè)質(zhì)量濃度下都能穩(wěn)定生長(zhǎng)，為了有效地提高菌株的耐鹽性，故選擇琥珀酸鈉質(zhì)量濃度50 g/L作為適應(yīng)性進(jìn)化的初始濃度。

表2 不同琥珀酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of sodium succinate concentrations on the growth of Actinobacillus succinogenes

表3 高鹽質(zhì)量濃度下菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定性驗(yàn)證Table 3 Growth stability of Actinobacillus succinogenes under a high salt concentration

2.3 菌株耐鹽性適應(yīng)性進(jìn)化

2.3.1 第一輪和第二輪適應(yīng)性進(jìn)化 第一輪適應(yīng)性進(jìn)化在含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為50 g/L的一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行了14代傳代，菌株OD660值變化情況見(jiàn)圖1（a）?？梢钥闯觯暝谠擕}質(zhì)量濃度下進(jìn)化過(guò)程中，由于高鹽質(zhì)量濃度的抑制作用，菌體生長(zhǎng)量連續(xù)下降，到第14代時(shí)，菌體OD660值降到0.60左右，生長(zhǎng)受到顯著抑制，故結(jié)束第一輪適應(yīng)性進(jìn)化。取適應(yīng)性進(jìn)化的菌液在TSB平板上劃線培養(yǎng)后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到裝有不含鹽的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)幾次復(fù)壯菌株并保藏于甘油管中備用。取復(fù)壯后菌株發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量為（32.7±2.50）g/L，相比于初始菌株沒(méi)有明顯變化。

圖1 第一輪和第二輪適應(yīng)性進(jìn)化（50 g/L琥珀酸鈉）過(guò)程中菌液OD660值變化情況Fig.1 Changes of OD660during the first and second round of adaptive evolution（50 g/L of sodium succinate）

使用粘膠纖維固定第一輪適應(yīng)性進(jìn)化后保藏的菌株，轉(zhuǎn)接入含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為50 g/L的一級(jí)種子培養(yǎng)基中開(kāi)始進(jìn)行第二輪適應(yīng)性進(jìn)化，共傳代19代，菌株OD660值變化情況見(jiàn)圖1（b）?？梢钥闯觯w生長(zhǎng)量先降低，最后達(dá)到穩(wěn)定并開(kāi)始漸漸回升，這說(shuō)明菌體的耐鹽性可能有所提高。取適應(yīng)性進(jìn)化的菌液在TSB平板上劃線，在37℃、充滿CO2氣體的條件下，靜置培養(yǎng)24 h。從長(zhǎng)好的平板上挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到不加鹽的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)幾次復(fù)壯菌株并保藏于甘油管中備用。取復(fù)壯后菌株發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量為33.2±3.35 g/L，相比于初始菌株琥珀酸產(chǎn)量提高了7.1%。2.3.2 紫外誘變 為了提高適應(yīng)性進(jìn)化效率，對(duì)第二輪適應(yīng)性進(jìn)化后菌株進(jìn)行紫外誘變。分別取稀釋合適倍數(shù)的后培養(yǎng)液涂布于含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為 60、70、80 g/L的TSB平板上，在 37℃、充滿 CO2氣體的條件下靜置培養(yǎng)3~5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，60 g/L的TSB平板上長(zhǎng)出單菌落，而70 g/L和80 g/L的TSB平板上沒(méi)有任何菌落長(zhǎng)出，故選擇含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為60 g/L的TSB平板作為篩選平板。菌株經(jīng)紫外線照射20 s后的致死率為78.4%。因此，紫外照射時(shí)間確定為20 s。取誘變后菌株發(fā)酵驗(yàn)證，共篩選出7株正突變株，編號(hào)為UV-1、UV-11、UV-16、UV-25、UV-31、UV-33、UV-39， 其中琥珀酸產(chǎn)量最高的是UV-1，其產(chǎn)量為34.6±3.62 g/L。隨后用UV-1作為第三輪適應(yīng)性進(jìn)化的出發(fā)菌株繼續(xù)進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化。

2.3.3 第三輪、第四輪適應(yīng)性進(jìn)化 取誘變后菌株在含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為60 g/L的一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，菌株OD660值變化情況見(jiàn)圖2（a）?？梢钥闯?，菌株生長(zhǎng)量先下降后回升再下降。分析原因可能是由于菌體富集生長(zhǎng)形成生物膜，提高了菌體對(duì)環(huán)境刺激的耐受性，菌株生長(zhǎng)量逐漸回升，但由于生物膜的保護(hù)作用有限故后又下降。取適應(yīng)性進(jìn)化的菌液在TSB平板上劃線培養(yǎng)后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到裝有不加鹽的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)幾次，復(fù)壯菌株并保藏于甘油管中備用。取復(fù)壯后菌株發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量為35.5±3.80 g/L，相比于初始菌株琥珀酸產(chǎn)量提高了14.5%。

使用粘膠纖維固定第三輪適應(yīng)性進(jìn)化后保藏的菌株，轉(zhuǎn)接入含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為60 g/L的一級(jí)種子培養(yǎng)基中開(kāi)始進(jìn)行第四輪適應(yīng)性進(jìn)化，共傳代19代，菌株OD660值變化情況見(jiàn)圖2（b）?？梢钥闯鼍晟L(zhǎng)量逐漸上升，比第三輪適應(yīng)性進(jìn)化菌株最終OD660值明顯提升，說(shuō)明菌株的耐鹽性可能進(jìn)一步提升。取適應(yīng)性進(jìn)化的菌液在TSB平板上劃線培養(yǎng)后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到裝有不加鹽的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)幾次復(fù)壯菌株并保藏于甘油管中備用。發(fā)酵驗(yàn)證表明，復(fù)壯后的菌株發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸（36.9±2.78）g/L，相比于初始菌株提高了19.0%。

圖2 第三輪和第四輪適應(yīng)性進(jìn)化（60 g/L琥珀酸鈉）過(guò)程中菌株OD660值變化情況Fig.2 Changes of strain’s OD660 during the third and fourth round of adaptive evolution （60 g/L of sodium succinate）

2.3.4 第五輪適應(yīng)性進(jìn)化 使用粘膠纖維固定第四輪適應(yīng)性進(jìn)化后保藏的菌株，轉(zhuǎn)接入含琥珀酸鈉質(zhì)量濃度為65 g/L的一級(jí)種子培養(yǎng)基中開(kāi)始進(jìn)行第三輪適應(yīng)性進(jìn)化，共傳代15代，菌株OD660值變化情況見(jiàn)圖3。可以看出，雖然菌體生長(zhǎng)量較在含丁二酸鈉60 g/L時(shí)低，但生長(zhǎng)量總的趨勢(shì)是呈上升狀的，菌株的耐鹽性得到進(jìn)一步提高。取適應(yīng)性進(jìn)化的菌液在TSB平板上劃線培養(yǎng)后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種到裝有不加鹽的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)幾次復(fù)壯菌株并保藏于甘油管中備用。

圖3 第五輪適應(yīng)性進(jìn)化 （65 g/L琥珀酸鈉）過(guò)程中菌株OD660值變化情況Fig.3 Changes of strain’s OD660during the fifth round of adaptive evolution（65 g/L of sodium succinate）

2.3.5 載體上附著菌體生長(zhǎng)情況 為了證實(shí)生物膜的形成，選取第三輪適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程為研究對(duì)象，通過(guò)掃描電鏡觀察適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中固定在纖維表面的Actinobacillus succinogenes，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4（a）可知，本輪適應(yīng)性進(jìn)化剛開(kāi)始時(shí)，菌體在載體上的覆蓋量不大；隨后菌體在載體上增殖并保持良好的短桿狀形貌，且菌體易于附著于纖維交叉處，而微米纖維膜較大的比表面積以及良好的孔洞貫通性能賦予了菌體更多附著生長(zhǎng)的位點(diǎn)；到適應(yīng)性進(jìn)化后期，載體表面覆蓋一層致密的生物膜，Actinobacillus succinogenes實(shí)現(xiàn)大量富集。

圖4 琥珀酸放線桿菌在載體表面形貌掃描電鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscope images of Actinobacillus succinogenes during adaptive evolution

2.4 初始菌株與適應(yīng)性進(jìn)化菌株性能比較

2.4.1 生長(zhǎng)情況 比較初始菌株與適應(yīng)性進(jìn)化菌株在不同條件下二級(jí)種子生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯觯?jīng)過(guò)五輪的適應(yīng)性進(jìn)化之后，菌株的耐鹽性能得到顯著提高。初始菌株在60 g/L鹽質(zhì)量濃度下幾乎不生長(zhǎng)，而經(jīng)過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化后菌株在含鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量逐漸提高，第五輪適應(yīng)性進(jìn)化后菌液OD660值能生長(zhǎng)到初始菌株不加鹽生長(zhǎng)時(shí)的1/3左右。

表4 初始菌株、適應(yīng)性進(jìn)化菌株不同條件下二級(jí)種生長(zhǎng)情況Table 4 Secondary seed growth of the original and the evoluted strains under different conditions

2.4.2 搖瓶發(fā)酵 發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢钥闯?，在同等發(fā)酵條件下，適應(yīng)性進(jìn)化菌株琥珀酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率明顯比初始菌株高，進(jìn)化菌株發(fā)酵得到38.4±3.14 g/L的琥珀酸，相比初始菌株產(chǎn)量約提高了23.8%，且適應(yīng)性進(jìn)化菌株耐鹽性得到了明顯提高。

圖5 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Results of flask fermentation

2.4.3 發(fā)酵罐發(fā)酵 用3 L發(fā)酵罐分別驗(yàn)證初始以及適應(yīng)性進(jìn)化后獲得的Actinobacillus succinogenes對(duì)琥珀酸的生產(chǎn)情況。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵策略，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于10 g/L時(shí)，一次性加入高質(zhì)量濃度的葡萄糖使得發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L左右，待殘?zhí)琴|(zhì)量濃度再一次降低為10 g/L以下時(shí)，采取相似補(bǔ)料操作，共補(bǔ)料3次。初始菌株發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖 6（a），進(jìn)化菌株發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖 6（b）。原始菌株補(bǔ)料分批發(fā)酵74 h，產(chǎn)琥珀酸82.6 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度 1.12 g/（L·h），糖酸轉(zhuǎn)化率為 68.9%；進(jìn)化后獲得的菌株分批發(fā)酵62 h，產(chǎn)琥珀酸86.3 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.39 g/（L·h），糖酸轉(zhuǎn)化率 78.7%。 相比于原始菌株，進(jìn)化后獲得的菌株糖酸轉(zhuǎn)化率提高14.2%，琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高24.1%。

圖6 初始菌株和適應(yīng)性進(jìn)化菌株在3 L發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸Fig.6 Succinic acid production with the original strain and the evoluted strain in a 3 L fermenter

3 結(jié)語(yǔ)

作者以粘膠作為載體構(gòu)建纖維床反應(yīng)器進(jìn)行耐鹽性琥珀酸放線桿菌的選育，其特色在于通過(guò)微生物的富集作用，為菌種選育提供了一種普適性的新方法。作者構(gòu)建基于固定化琥珀酸放線桿菌的小型纖維床反應(yīng)器，并將琥珀酸放線桿菌在含50 g/L琥珀酸鈉的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。進(jìn)過(guò)兩輪適應(yīng)性進(jìn)化之后，為提高適應(yīng)性進(jìn)化效率，對(duì)第二輪適應(yīng)性進(jìn)化所得菌株進(jìn)行紫外誘變，篩選出琥珀酸產(chǎn)量最高的正突變株UV-1，其產(chǎn)量為34.6 g/L。隨后用UV-1繼續(xù)進(jìn)行第三輪適應(yīng)性進(jìn)化，并提高琥珀酸鈉質(zhì)量濃度到60 g/L和65 g/L。最終選育出的菌株耐鹽性能得到明顯提高，能在含60 g/L琥珀酸鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。利用進(jìn)化菌株菌液搖瓶發(fā)酵的琥珀酸產(chǎn)量為38.4±3.14 g/L，比初始菌株提高了23.8%。在3 L發(fā)酵罐分別對(duì)進(jìn)化前后的菌株進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的驗(yàn)證，相比于原始菌株，進(jìn)化后獲得的菌株糖酸轉(zhuǎn)化率提高14.2%，琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高24.1%。后期擬通過(guò)基因測(cè)序?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步挖掘適應(yīng)性進(jìn)化前后菌株分子生物學(xué)方面的有用信息。