刁婷婷 田 騁 王洪亮 姜玉珍

(南陽醫(yī)專第一附屬醫(yī)院，南陽 473000)

隨著未來人口老齡化的增加，眼病發(fā)病率及治療費(fèi)用也將不斷增加[1]。過去幾十年的數(shù)據(jù)顯示白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜黃斑變性及增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變等是主要的致盲性眼病[2]。研究表明脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管新生是這些眼病致盲的主要原因，神經(jīng)組織的高氧需求與局部缺氧之間的失衡會(huì)引起一系列血管相關(guān)生長因子的釋放，從而刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而誘導(dǎo)血管新生[3]。目前已存在一些治療眼病的方法，但眼病仍然是一個(gè)巨大的健康問題，給患者和社會(huì)帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。開發(fā)新的有效的眼病治療方法對(duì)公共衛(wèi)生健康系統(tǒng)具有重要意義。淫羊藿是一種重要的藥用植物，在數(shù)千年的時(shí)間里被用于各種傳統(tǒng)的中國配方以及現(xiàn)代中國傳統(tǒng)的中藥產(chǎn)品中。淫羊藿苷(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種典型的黃酮糖苷，被認(rèn)為是天然草藥淫羊霍的主要活性成分[4]。淫羊藿苷具有多種藥理學(xué)活性，如骨保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)、抗癌及抗炎等作用[5,6]。本文主要目的是探索淫羊藿苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞系RF/6A增生和運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

圖1 淫羊藿苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of Icariin

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑 恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。淫羊藿苷購自Sigma公司。MTT購自上海生工。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司?？寡軆?nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF),抗p-PI3K、抗 p-AKT和抗Rac抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理 恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A分四組：正常組(Normal)：常氧處理RF/6A；對(duì)照加藥組(Icariin)：常氧+淫羊藿苷(100 μmol/L)處理RF/6A；缺氧組(Hypoxia)：缺氧處理RF/6A細(xì)胞；缺氧加藥組(Hypoxia+Icariin)：缺氧和Icariin一起處理RF/6A細(xì)胞。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞接種于96孔板中，淫羊藿苷處理24、48、72和96 h后分別加入MTT溶液孵育4 h，棄上清，然后加入DMSO振蕩10 min以溶解結(jié)晶物。最后570 nm處檢測吸光度值。

1.2.3Transwell檢測細(xì)胞侵襲 首先用無血清培養(yǎng)基將待測細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。接著用0.5%的結(jié)晶紫對(duì)上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽除去上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種到6孔板中培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。在單層細(xì)胞上用10 μl的槍頭劃線，用PBS洗去因劃線而脫落的細(xì)胞。顯微鏡下觀察拍照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再取出觀察拍照。

1.2.5蛋白印跡 用PBS漂洗細(xì)胞后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA封閉1 h后加入對(duì)應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為存在明顯差異，P<0.01認(rèn)為存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001認(rèn)為存在極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧處理RF/6A后細(xì)胞數(shù)目增多，正常組和對(duì)照加藥組細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，缺氧加藥組細(xì)胞數(shù)目少于缺氧組(圖2)。由圖3可知，缺氧組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與缺氧組相比，缺氧加藥組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯下降(P<0.05)。上述結(jié)果表明，淫羊藿苷可抑制缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞增殖能力的提高。

2.2淫羊藿苷可降低缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng) 利用Transwell檢測細(xì)胞侵襲，探究淫羊藿苷對(duì)缺氧處理的RF/6A細(xì)胞侵襲能力的影響。圖4顯示，正常組和對(duì)照加藥組平均每個(gè)視野下穿過基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)目無明顯差異。缺氧組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯多于正常組(P<0.05)。與缺氧組相比，缺氧加藥組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯變少(P<0.05)。由此可見，淫羊藿苷會(huì)逆轉(zhuǎn)缺氧造成的RF/6A細(xì)胞侵襲能力的升高。

2.3淫羊藿苷會(huì)減弱缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞遷移能力的提高 為分析淫羊藿苷對(duì)缺氧處理的RF/6A細(xì)胞遷移能力的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移。如圖5所示，正常組和對(duì)照加藥組劃痕愈合率無明顯變化。與正常組相比，缺氧組劃痕愈合率明顯上升(P<0.05)。但缺氧加藥組劃痕愈合率卻明顯低于缺氧組(P<0.05)。上述結(jié)果說明，淫羊藿苷抑制缺氧對(duì)RF/6A細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)作用。

圖2 RF/6A細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Morphology of RF/6A cells

圖3 MTT檢測細(xì)胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by MTTNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

圖4 Transwell檢測細(xì)胞侵襲Fig.4 Cell invasion was detected by TranswellNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移Fig.5 Cell migration was measured by wound healingNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

圖6 蛋白印跡檢測VEGF通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of VEGF related proteins were tested by Western blotNote: **.P<0.01,***.P<0.001 vs normal group,#.P<0.05 vs hypoxia.

2.4淫羊藿苷可抑制缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞中VEGF通路的激活 為探索淫羊藿苷影響缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞的分子機(jī)制，蛋白印跡檢測VEGF通路相關(guān)蛋白VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac的表達(dá)。圖6顯示，缺氧組VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.01)。與缺氧組相比，缺氧加藥組VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac表達(dá)明顯降低(P<0.01)。由此可見，淫羊藿苷可抑制缺氧引起的VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平的升高，從而抑制VEGF通路的激活。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞在血管新生過程中起著重要作用[7]。目前抗VEGF是眼部血管新生的標(biāo)準(zhǔn)治療策略，該治療策略已被廣泛應(yīng)用于各種視網(wǎng)膜血管疾病，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜靜脈阻塞[8]。但這些抗VEGF藥物存在著一些眼部或全身性的副作用。天然產(chǎn)物因具有高化學(xué)多樣性和生物化學(xué)特性而受到了越來越多的關(guān)注。許多天然產(chǎn)物被認(rèn)為具有成為抗血管新生的潛力，有利于血管新生相關(guān)疾病的治療[9]。

細(xì)胞增殖調(diào)控在各類疾病中起著重要作用[10]。目前發(fā)現(xiàn)了多種可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的植物提取物。有研究表明金銀花水提取物可減弱VEGF誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞增殖[11]。Balaiya等[12]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞增殖。據(jù)報(bào)道淫羊藿苷會(huì)抑制低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖[13]。在卵巢癌細(xì)胞A2780中，淫羊藿苷處理會(huì)降低細(xì)胞增殖能力[14]。有數(shù)據(jù)顯示淫羊藿苷具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的功能[15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可減弱膽囊癌GBC-SD 和 SGC-996細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷可抑制缺氧對(duì)誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)作用。

越來越多的研究表明許多植物提取物具有抑制細(xì)胞侵襲的功效。有研究顯示野艾蒿提取物可減弱人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞侵襲[17]。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)山紫菀乙醇提取物可降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力。據(jù)報(bào)道淫羊藿苷可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲[19]。在惡性膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞中，淫羊藿苷處理會(huì)減弱侵襲能力[20]。有數(shù)據(jù)顯示淫羊藿苷可降低高轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞PG的侵襲能力[21]。本文結(jié)果表明，淫羊藿苷可抑制缺氧對(duì)RF/6A細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)作用。

大量文獻(xiàn)報(bào)道了植物提取物可抑制細(xì)胞遷移。Li等[22]發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制VEGF誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞遷移。有數(shù)據(jù)表明槲皮黃酮會(huì)以一種濃度依賴型的方式減弱RF/6A細(xì)胞遷移能力[23]。據(jù)報(bào)道山茶花果實(shí)提取物可降低血小板衍生因子BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移[24]。有研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可減弱食管鱗狀上皮細(xì)胞癌EC109 和TE1 ESCC細(xì)胞遷移[25]。在肺腺癌細(xì)胞A549中，淫羊藿苷可抑制細(xì)胞遷移[26]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞中，淫羊藿苷處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力下降。

PI3K/AKT信號(hào)通路在各類疾病中發(fā)揮著重要作用[27-31]。據(jù)報(bào)道VEGF可通過PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)RF/6A細(xì)胞增殖及血管形成[32]。Yu等[33]發(fā)現(xiàn)毛蘭素可降低高糖誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞VEGF表達(dá)，減弱VEGF誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化水平的升高，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活。有研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，淫羊藿苷處理可降低VEGF的分泌[34]。據(jù)報(bào)道在食管癌細(xì)胞KYSE70中，淫羊藿苷處理會(huì)降低p-AKT蛋白水平，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化[35]。本文結(jié)果表明，淫羊藿苷可減弱缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平的升高，抑制PI3K/AKT通路的激活。

本研究表明，在缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞中，淫羊藿苷會(huì)減弱細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，降低VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平。綜上所述，淫羊藿苷可通過VEGF/PI3K/AKT通路抑制缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。下一步計(jì)劃通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究淫羊藿苷對(duì)視網(wǎng)膜血管新生相關(guān)疾病的影響。