韓興濤 楊凌博 魏澎濤 李小輝 孫建濤 楊錦建

(洛陽市中心醫(yī)院泌尿外科，洛陽 471000)

前列腺癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，尤其是在發(fā)達(dá)國家，前列腺癌的發(fā)病率一直居高不下[1]。雖然亞洲地區(qū)的前列腺癌發(fā)生率稍低于西方發(fā)達(dá)國家，但是近年來有不斷增長的趨勢[2]。廣泛的前列腺特異性抗原篩選技術(shù)的進(jìn)步使前列腺癌的早期診斷率有所增加[3]。但是目前仍沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，研究前列腺癌發(fā)展的分子和細(xì)胞機(jī)制是目前的主要研究熱點(diǎn)。

前列腺癌基因3(Prostate cancer antigen 3，PCA3)是在前列腺癌組織發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)水平異常的分子標(biāo)志物[4]。PCA3是一種具有自我更新能力的基因，在多種人類腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等[5-8]。PCA3還是一種具有促癌作用的功能性lncRNAs，有研究指出PCA3的表達(dá)異?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞生長速度減緩，影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程[9]。

微小RNA(miRNA)是一種單鏈非編碼的調(diào)節(jié)RNA，可以通過堿基配對起到抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的作用，從而影響mRNA翻譯或降解過程[10]。異常表達(dá)miRNA在各種人類惡性實(shí)體腫瘤中都存在，包括前列腺癌[11]。有研究發(fā)現(xiàn)由miR-194介導(dǎo)的BMI蛋白表達(dá)的機(jī)制與前列腺癌的侵襲直接相關(guān)[12]。因此探討相關(guān)miRNA在前列腺癌中的表達(dá)及機(jī)制有助于推動前列腺癌的診斷和治療的進(jìn)展。

本研究擬探討PCA3和miR-194對下游通路蛋白的影響作用，通過對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的驗(yàn)證及下游通路的激活情況，明確PCA3和miR-194在前列腺癌中的可能作用機(jī)制，以期為前列腺癌的診治提供一個潛在的新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1材料 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M-2B4、PC3、Du145和LNCaP均購自上海細(xì)胞研究所，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。Ras、MEK1、MEK2抗體購自美國Abcam公司(ab52939、ab32091、ab32517)。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、PCA3+siRNA和miR-194-mimic購自重慶艾生生物科技公司。Trizol購自北京天辰生物科技公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購自日本TOYOBO公司(FSQ-101)。PCR試劑盒購自成都榮海生物公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京Promega公司。熒光素酶報告載體購自上海吉爾生物公司。

1.2方法

1.2.1qPCR試驗(yàn) 使用Trizol試劑提取前列腺癌細(xì)胞的總RNA，并使用TM miRNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)進(jìn)一步純化miRNA部分。通過光譜測定RNA樣品的濃度和純度。PCA3的引物序列：5′-CATTTATATTGCTGGCCCTTCTGC-TTTC-3′(正向)和5′-GAAAGCAGAAGGGCCATAAAAGTAATG-3′(反向)。 miR-194的引物序列：5′-GAGTTTGATCATGGCTCAGAGAGTTTGATCCTG-3′(正向)和5′-CGACGGCCAGTCTTACCAGGAAACAGCTATG3′(反向)。使用實(shí)時PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時反轉(zhuǎn)錄PCR(qPCR)。使用U6管家基因作為對照。使用2-ΔΔCt方法計算肺癌細(xì)胞的miRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2雙熒光素酶活性測定 為了檢測PCA3和miR-194的相關(guān)關(guān)系，我們使用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測定，將24孔板中的LNCaP細(xì)胞與0.4 mg熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對照載體共轉(zhuǎn)染，根據(jù) siPORTneoFX使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)(Promega)，測定轉(zhuǎn)染24 h后熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞的增殖能力 常規(guī)培養(yǎng)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心3 min，離心半徑12 cm，棄去上清液。加入5 ml的無菌PBS溶液，輕輕吹散洗滌細(xì)胞沉淀并再次離心。反復(fù)洗滌3次后加入培養(yǎng)液，制備成單細(xì)胞懸液。測定前列腺癌LNCaP細(xì)胞濃度并調(diào)整為1 000 cells/ml，將單細(xì)胞懸液均勻種植在無菌6孔板內(nèi)，進(jìn)行克隆形成培養(yǎng)。分為PCA3+siRNA實(shí)驗(yàn)組和NC對照組。每3 d更換一次培養(yǎng)基，14 d后觀察腫瘤細(xì)胞克隆形成情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前約24 h，接種兩瓶LNCaP細(xì)胞，標(biāo)記①、②，每瓶含約6 ml培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)前約2.5 h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml;②號瓶中加入同等量的PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h。染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入配置液2 μl，PI 染液20 μl，染色15 min。滴片：取載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10 μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例。

1.2.5Western blot蛋白印跡分析 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(Ras、MEK1、MEK2濃度1∶1 000)，內(nèi)參GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標(biāo)記物(濃度1∶2 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用碧云天化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影液檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。使用GAPDH作蛋白內(nèi)參對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。組間數(shù)據(jù)分析使用t檢驗(yàn)。P<0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1前列腺癌細(xì)胞株中PCA3和miR-194的表達(dá)水平 qPCR結(jié)果表明：與其他細(xì)胞株相比，LNCaP細(xì)胞中PCA3 mRNA表達(dá)水平明顯較高[(1.52±0.23) vs (0.29±0.08)，P=0.004]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1A；miR-194在LNCaP細(xì)胞株中表達(dá)水平比其他前列腺癌細(xì)胞低(P=0.016)，見圖1B。所以我們挑選LNCaP作為進(jìn)一步生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

2.2雙熒光素酶檢測PCA3和miR-194之間的關(guān)系 為明確與PCA3相關(guān)的miRNA的情況，我們使用生物信息學(xué)預(yù)測工具發(fā)現(xiàn)PCA3可能與miR-194有直接作用，兩者有相似的結(jié)合序列，見圖2A。為了驗(yàn)證PCA3能否與miR-194 3′UTR結(jié)合，我們將PCA3-siRNA與miR-194共轉(zhuǎn)染到前列腺癌LNCaP細(xì)胞中。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示：PCA3-siRNA可以明顯抑制miR-194的熒光素酶活性(P=0.025)，見圖2B。結(jié)果表明，PCA3-siRNA能與miR-194的3′UTR特異性結(jié)合。

圖1 PCA3和miR-194在前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.1 PCA3 and miR-194 expression in prostate cancer cell lines

圖2 雙熒光素酶檢測PCA3和miR-194之間的關(guān)系Fig.2 Dual luciferase assay for the relationship between PCA3 and miR-194Note:A.Binding sites for PCA3 and miR-194;B.Double luciferase to detect the relationship between PCA3 and miR-194.*.P<0.05.

2.3PCA3對前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 克隆形成結(jié)果顯示(圖3A、B)：PCA3+siRNA組的細(xì)胞數(shù)目明顯少于NC對照組的細(xì)胞數(shù)目[(170.25±5.61)vs(58.36±3.95)，P=0.019]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。凋亡試驗(yàn)結(jié)果表明，PCA3+siRNA組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯多于NC對照組的細(xì)胞凋亡數(shù)目，表明PCA3可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡行為，見圖3C。綜上結(jié)果表明，抑制PCA3的表達(dá)可以減弱前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖能力，且可在一定程度上加速其凋亡進(jìn)程。

2.4miR-194和PCA3對前列腺癌細(xì)胞增殖作用的逆轉(zhuǎn)影響 為了檢測miR-194和PCA3對前列腺癌LNcaP細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，克隆形成結(jié)果顯示(圖3A)：PCA3-siRNA+miR-194-mimic組的細(xì)胞數(shù)目明顯多于PCA3+siRNA的細(xì)胞數(shù)目[(195.59±11.42)vs(78.34±5.64)，P=0.008]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4A、B。凋亡試驗(yàn)結(jié)果(圖4C)，表明PCA3+siRNA+miR-194-mimic組細(xì)胞凋亡數(shù)目與PCA3+siRNA組的細(xì)胞凋亡數(shù)目相近，說明miR-194可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的凋亡行為。綜上結(jié)果表明，miR-194可以逆轉(zhuǎn)PCA3對前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖能力的影響，且可在一定程度上逆轉(zhuǎn)LNCaP細(xì)胞的凋亡行為。

圖3 PCA3對前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of PCA3 on proliferation and apoptosis of prostate cancer cellsNote:A.Effect of PCA3 on proliferation of prostate cancer cells;B.PCA3 on apoptosis of prostate cancer cells;C.Apoptosis assay was used to detect the effects of PCA3 on the apoptosis of prostate cancer cells.*.P<0.05.

圖4 miR194對PCA3逆轉(zhuǎn)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of miR-194 on the reversal effect of PCA3 on proliferation of prostate cancer cellsNote:A.miR-194 reverses the proliferation of prostate cancer LNcaP cells;B.miR-194 on apoptosis of LNCaP cells in prostate cancer;C.Apoptosis assay was used to detect the effects of PCA3 and miR-194 on the apoptosis of prostate cancer cells.*.P<0.05.

圖5 PCA3對ERK信號通路的激活情況Fig.5 Activation of ERK signaling pathway by PCA3Note:A.Effect of PCA3 on protein expression in ERK signaling pathway;B.The corresponding expression level of the ERK signaling pathway protein.*.P<0.05.

圖6 miR-194對ERK信號通路的影響Fig.6 Effect of miR-194 on ERK signaling pathwayNote:A.Effect of miR-194 on the reversal of protein levels in ERK signaling pathway;B.Effects of miR-194 on the expression of ERK signaling protein.*.P<0.05.

圖7 抑制PCA3后前列腺癌LNCaP細(xì)胞成瘤能力減弱Fig.7 Prostate cancer LNCaP cells have reduced tumorigenic ability after inhibition of PCA3Note:A.Ability in the vivo tumorigenicity of LNCaP cells were enhanced in nude mice after silencing PCA3;B，C.Comparison of tumor volume and quality in nude mice.*.P<0.05.

2.5PCA3對ERK信號通路的激活情況 在PCA3+siRNA實(shí)驗(yàn)組中MEK1和MEK2的表達(dá)情況比NC組的明顯降低[MEK1(0.85±0.16)% vs(0.25±0.05)%，P=0.016；MEK2(0.89±0.09)% vs(0.36±0.10)%，P=0.019]，而Ras的表達(dá)水平升高[Ras(0.51±0.06)% vs(0.98±0.12)%，P=0.021]，見圖5A、B。結(jié)果表明，抑制PCA3后，ERK信號通路相關(guān)蛋白的激活水平受到一定的影響，表明PCA3的表達(dá)和ERK信號通路的激活有相關(guān)關(guān)系。

2.6miR-194對ERK信號通路的影響 在PCA3+siRNA+miR-194-mimic組中MEK1和MEK2的表達(dá)情況相比PCA3+siRNA組升高[MEK1(0.52±0.06)% vs(0.21±0.05)%，P=0.033；MEK2(0.75±0.11)% vs(0.31±0.08)%，P=0.031]，而Ras的表達(dá)水平升高[Ras(0.60±0.06)% vs(1.23±0.22)%，P=0.013]，見圖6A、B。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-194后，ERK信號通路相關(guān)蛋白水平得到一定的恢復(fù)，表明miR-194在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)PCA3對ERK信號通路的抑制作用，間接說明PCA3可能是通過miR-194對下游ERK信號通路進(jìn)行調(diào)控的。

2.7抑制PCA3后，前列腺癌LNCaP細(xì)胞成瘤能力減弱 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，抑制PCA3后的前列腺癌LNCaP細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力明顯減弱，4周后腫瘤體積較對照組大[(1.35±0.15)cm3vs(0.39±0.16)cm3，P<0.05]，4周后腫瘤質(zhì)量較對照組重[(1.34±0.09)g vs (0.42±0.12)g，P<0.05],差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖7。說明抑制PCA3后前列腺癌LNCaP細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)成瘤能力相應(yīng)減弱。表明PCA3對前列腺癌細(xì)胞的成瘤能力有一定的增強(qiáng)作用，可能在前列腺癌的發(fā)展過程中起到一定的促癌作用。

3 討論

前列腺癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，尤其在西方發(fā)達(dá)國家[13]。目前前列腺癌的早期檢測主要依賴于直腸指檢和前列腺特異性抗原(PSA)的篩查，但是，由于其陽性預(yù)測值較低，只有10%～35%的患者可以早期篩查出來，而且前列腺活檢的可實(shí)施性不高[14]。針對前列腺癌的分子基因方面的研究是目前的研究熱點(diǎn)，尤其是新的前列腺癌基因篩查。

美國學(xué)者報道，PCA3針對前列腺癌的診斷準(zhǔn)確性較高，在多數(shù)前列腺癌患者中都存在異常表達(dá)，和PSA聯(lián)合篩查可以提高前列腺癌72%的診斷特異性和58%的敏感度[15]。也有學(xué)者指出，PCA3和前列腺癌的臨床病理參數(shù)有一定的關(guān)聯(lián)[16]。以前的研究已經(jīng)將PCA3列為前列腺癌的高效診斷指標(biāo)，然而其在前列腺癌中的作用方式及機(jī)制說法不一。我們通過生物信息學(xué)預(yù)測PCA3和相關(guān)miRNA在前列腺癌中的表達(dá)關(guān)系，然后進(jìn)一步驗(yàn)證其可能的作用機(jī)制，為揭示PCA3在前列腺癌中的具體作用方式提供支持。

miRNA是一類內(nèi)源性的、高度保守的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于植物和多細(xì)胞動物的基因組中[17]。miR-194的編碼基因位于染色體12p36上，研究表明，miR-194受多種抑癌基因的直接調(diào)控，從而影響下游靶基因發(fā)揮生物學(xué)功能。何涵等[18]使用miR-194-mimic轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。miR-194已被證實(shí)在多種腫瘤的生長過程中扮演重要作用。例如，在最近的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，miR-194是通過減少肝細(xì)胞EMT來影響肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[19]。

本研究試圖通過研究PCA3和miR-194之間的相互關(guān)系，推斷出PCA3和miR-194在前列腺癌中的作用方式。首先通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)PCA3可以調(diào)控miR-194的表達(dá)及活性，然后通過MTT增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測PCA3對前列腺癌細(xì)胞增殖能力和凋亡行為的促進(jìn)作用，之后轉(zhuǎn)染miR-194-inhibitor后發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞被抑制的增殖能力和凋亡行為得到一定程度的逆轉(zhuǎn)，表明PCA3是通過調(diào)控miR-194表達(dá)活性影響前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。同時Western blot實(shí)驗(yàn)檢測到ERK信號通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平也受PCA3和miR-194的調(diào)控。ERK信號通路受到多種miRNA調(diào)控，介導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞的生長和凋亡行為[20]。針對ERK通路蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平不同，有研究提出其可能和細(xì)胞表面受體數(shù)量和活性相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)或激活時，可以影響細(xì)胞本身的增殖行為[21]。

本研究通過以上實(shí)驗(yàn)提示PCA3和miR-194可能通過ERK信號通路參與前列腺癌細(xì)胞增殖過程和凋亡行為，為前列腺癌的早期診斷和治療方式的改變提供一定的理論支持，為前列腺癌的治療效果和預(yù)后監(jiān)測提供幫助。