吳世舜 余文博 劉夢(mèng)元 張海謀 熊 君 劉東旭

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430062)

在體內(nèi)，炎癥引起組織損傷可迅速導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，在很大程度上，主要依賴(lài)于單核-巨噬細(xì)胞系的極化，這種變化主要是由于血中單核細(xì)胞浸潤(rùn)，成為靜息巨噬細(xì)胞。這些靜息巨噬細(xì)胞在細(xì)胞因子的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌偷臉O化巨噬細(xì)胞[1]。在體外，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CSF)或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)均可促使單核細(xì)胞分化為靜息巨噬細(xì)胞，而干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(IL-4)+IL-13可誘導(dǎo)靜息巨噬細(xì)胞分別轉(zhuǎn)化為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1)和替代激活的巨噬細(xì)胞(M2)[2,3]。巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的差異性極化能力，可隨具有不同功能表型之間動(dòng)態(tài)變化而相互轉(zhuǎn)換[4]。人巨噬細(xì)胞表型的表達(dá)CD14、CD163、CD206是區(qū)分M1和M2的重要標(biāo)記物[5]，也是巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)明顯極化能力的標(biāo)志。M1產(chǎn)生大量的具有促炎性特性的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和趨化因子(C-C motif)配體17(CCL17)及相關(guān)的酶如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。而M2則產(chǎn)生大量的具有抗炎作用物質(zhì)如15脂氧合酶(ALOX15)、IL-10和CCL18和精氨酸酶1(Arg1)[4,6,7]。

補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白C1抑制劑(C1INH)是補(bǔ)體系統(tǒng)中經(jīng)典途徑唯一蛋白酶抑制劑，C1INH 存在于人體血漿中。巨噬細(xì)胞也是參與執(zhí)行補(bǔ)體系統(tǒng)中途徑效應(yīng)功能的關(guān)鍵因素。補(bǔ)體系統(tǒng)的成分對(duì)巨噬細(xì)胞極化起調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，補(bǔ)體蛋白C1q可以直接巨噬細(xì)胞極化[8]。補(bǔ)體成分C1q、C3b和C5a與巨噬細(xì)胞上的受體相互作用，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。C3a、C5a和C5b-9調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞趨向炎性M1表型，促炎細(xì)胞因子的釋放，而C3b、C1q調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞趨向抗炎性M2表型，抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些變化可能與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)作用有關(guān)[9]。既往研究已經(jīng)證實(shí)：C1INH具有抗炎的新功能，抑制巨噬細(xì)胞激活和炎性細(xì)胞因子釋放[10-12]。

本研究將分析C1INH對(duì)極化的巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD14、CD163和CD206作用，研究C1INH對(duì)極化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和抗炎因子的作用，同時(shí)，探索C1INH對(duì)極化巨噬細(xì)胞殺菌活性和吞噬功能的作用。進(jìn)一步分析C1INH對(duì)CD14結(jié)合Toll樣受體4(TLR4)的影響。從而闡明C1INH對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 Ficoll PaqueTMPLUS單核細(xì)胞分離液購(gòu)自immunbioTM；M-CSF、GM-CSF、IFN-γ，IL-4，IL-13購(gòu)自R&D；C1INH購(gòu)自Berinert,ZLB Behring；Anti-CD14、anti-CD163，anti-CD206抗體，R&D；磷酸化的RAF-1、MEK-1和p42/p44ERK抗體購(gòu)自NEB；RNA Mini Kit和PCR Kit購(gòu)自Qiagen；96孔平底板購(gòu)自BD Biosciences；免疫反應(yīng)-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)購(gòu)自Pierce Biotechnology；pHrodoTMGreen E.coli BioParticlesTMConjugate和LPS購(gòu)自ThermoFisher。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞分離和誘導(dǎo) 健康成人外周血液樣本的研究得到湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有捐助者都知情同意。應(yīng)用17-1140-02 Ficoll PaqueTMPLUS 單核細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，分離所得的細(xì)胞中95%±5%為單核細(xì)胞，分離所得的細(xì)胞存活細(xì)胞率>90%。細(xì)胞培養(yǎng)濃度在1×106個(gè)細(xì)胞/ml，細(xì)胞在完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素/鏈霉素，加入50 ng/ml M-CSF或50 ng/ml GM-CSF，培養(yǎng)3 d后，再添加到含有生長(zhǎng)因子的新鮮培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞用1×PBS含Ca2+和Mg2+和新鮮的完全RPMI洗2次，再加入完全培養(yǎng)基含有100 ng/ml IFN-γ(M2)或10 ng/ml IL-4+10 ng/ml IL-13(M2)，培養(yǎng)48 h。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)立C1INH濃度為0、50、100、150、200 μg/ml，同時(shí)也設(shè)立C1INH作用時(shí)間0、12 h、24 h、48 h。因此，最后選定C1INH終濃度和作用時(shí)間為150 μg/ml和48 h。在上述實(shí)驗(yàn)組中，加入150 μg/ml C1INH、24 h作用時(shí)間，設(shè)立陰性對(duì)照組。通過(guò)檢測(cè)和鑒定，M-CSF或GM-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的純度分別為95%和96%。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè) 在培養(yǎng)的細(xì)胞加入抗體(CD14、CD163，CD206)進(jìn)行孵育，洗滌后再進(jìn)入二抗。細(xì)胞用PBS含Ca2+和Mg2+和新鮮的完全培養(yǎng)基洗2次，細(xì)胞固定后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD)，應(yīng)用CellQuest軟件分析結(jié)果。

1.2.3RT-PCR 從細(xì)胞中提取總RNA,并通過(guò)測(cè)量其在260 nm處的吸光度來(lái)定量測(cè)定總RNA的濃度，PCR Kit進(jìn)行qPCR分析，GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照引物，具體操作過(guò)程按試劑說(shuō)明書(shū)要求。反應(yīng)體系在95℃預(yù)變性30 s,40循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃ 5 s,60℃ 34 s)，熔解曲線(xiàn)分析,結(jié)果與內(nèi)參作對(duì)比。

1.2.4細(xì)胞殺菌試驗(yàn) 按以前方法操作[11]。簡(jiǎn)而言之，3×104細(xì)胞/孔接種于纖連蛋白涂覆的96孔平底板培養(yǎng)2 d。大腸桿菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5)的RPMI1640培養(yǎng)基含有10 nmol/L HEPES，細(xì)胞數(shù)與等量的大腸桿菌數(shù)目在37℃下共培養(yǎng)，并加入150 μg/ml C1INH，設(shè)立對(duì)照組。用冰冷的水和渦旋裂解細(xì)胞。在37℃下，將裂解物連續(xù)稀釋并涂于含5% FBS的瓊脂基片上，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)活菌數(shù)，測(cè)定存活細(xì)菌的百分比。

1.2.5細(xì)胞對(duì)菌的吞噬試驗(yàn) 按說(shuō)明書(shū)(生命技術(shù))方法操作，用FITC標(biāo)記大腸桿菌，進(jìn)行細(xì)胞吞噬試驗(yàn)。FITC標(biāo)記的細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5)的RPMI1640培養(yǎng)基含有10 nmol/L HEPES。隨后，細(xì)胞與等量的大腸桿菌數(shù)目在37℃下共培養(yǎng)，并加入150 μg/ml C1INH。細(xì)胞用PBS洗兩次去除非吞噬物質(zhì)，刮掉細(xì)胞，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記物的情況。

1.2.6Western blot 離心分離細(xì)胞裂解液，在4℃下過(guò)夜，1 mg蛋白質(zhì)用合適的抗體和蛋白A/G加瓊脂糖孵育。蛋白用10%聚丙烯酰胺分離凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜上蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體(磷酸化的RAF-1、MEK-1和p42/p44ERK抗體)結(jié)合，洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶抗體。免疫復(fù)合物通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1C1INH對(duì)M1和M2極化表型的作用 CD14是M1的表面標(biāo)記物，CD163是M-CSF源性巨噬細(xì)胞分化表面標(biāo)記物，CD206是IL-4誘導(dǎo)的M2表面標(biāo)記物[5,13,14]。在靜態(tài)狀態(tài)下，C1INH抑制M-CSF源性巨噬細(xì)胞的CD14、CD163和GM-CSF源性巨噬細(xì)胞的CD206表面標(biāo)記物的表達(dá)(圖1)。在極化狀態(tài)下,C1INH抑制M1的CD14、CD163和M2的CD206表面標(biāo)記物的表達(dá)(圖2)。結(jié)果提示：C1INH對(duì)巨噬細(xì)胞極化表面標(biāo)志物具有調(diào)節(jié)作用。

2.2C1INH對(duì)M1和M2的標(biāo)記基因表達(dá)的影響 IFN-γ或IL-13誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化不同的基因表達(dá)趨化因子和細(xì)胞因子是有差異的[5]。我們發(fā)現(xiàn)C1INH抑制M1的TNF-α和IL-6表達(dá)，而增加M2的15-脂氧合酶和IL-10表達(dá)(圖3A～D)。C1INH抑制M1 iNOSmRNA和提高M(jìn)2 Arg1 mRNA表達(dá)(圖3E、F)。 結(jié)果提示：C1INH具有調(diào)節(jié)M1和M2的標(biāo)記基因趨化因子和細(xì)胞因子分泌及相關(guān)酶表達(dá)。

圖1 C1INH對(duì)靜息巨噬細(xì)胞(CD14、CD163和CD206)表型的影響Fig.1 Effect of C1INH on phenotype(CD14，CD163 and CD206)of resting macrophagesNote: FITC-conjugated antibodies for CD14 (A),CD163 (B),and CD206 (C) were used.Flow cytometric measurement of surface marker expression depicted as fold change of mean fluorescence intensity (MFI) relative to the control in box plots for macrophages (n=6).*.P<0.05.

2.3C1INH提高極化巨噬細(xì)胞殺菌活性和對(duì)菌的吞噬功能 M1具有很高的殺菌活性[4,6,7]，而M2顯示吞噬功能比M1更大[15,16]。在實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)研究C1INH對(duì)M1的殺菌活性和M2的吞噬功能的作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在巨噬細(xì)胞對(duì)菌殺滅功能中，C1INH明顯的增強(qiáng)M1的殺菌活性功能(圖4A)。在分析巨噬細(xì)胞對(duì)菌的吞噬功能中，C1INH明顯的增加M2對(duì)菌吞噬功能(圖4B)。

圖2 C1INH對(duì)極化的M1和M2(CD14、CD163和CD206)表型的影響Fig.2 C1INH regulates phenotype(CD14，CD163 and CD206)of M1 and M2 polarizationNote: FITC-conjugated antibodies for CD14 (A),CD163 (B),and CD206 (C) were used.Flow cytometric measurement of surface marker expression depicted as fold change of mean fluorescence intensity (MFI) relative to the control in box plots for M1 (n=6) and M2 (n=6).*.P<0.05.

圖3 C1INH對(duì)M1和M2標(biāo)記基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of C1INH on expression of marker genes in M1 and M2Note: TNF-α(A),IL-6(B),ALOX15(C),IL-10(D),iNOS(E),and ARG1(F) were shown.Data are expressed as fold differences of polarized M1 (n=6) and M2 (n=6) with C1INH(n=6).*.P<0.05.

圖4 C1INH提高極化巨噬細(xì)胞的殺菌活性功能和對(duì)菌的吞噬功能Fig.4 C1INH improves bactericidal activity and phagocytosis of polarized macrophagesNote: A.Viable bacteria from M1 and M2 were detected and counted,and the percentage of surviving bacteria was determined;B.Phagocytosis tests were performed in M1 and M2 using FITC-labeled beads and then analyzed for the uptake of FITC-coupled beads by FACS.Data are expressed as fold differences of polarized M1 (n=6) and M2 (n=6) with C1INH (n=6)，*.P<0.05.

圖5 C1INH抑制極化巨噬細(xì)胞的CD14-TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.5 C1INH inhibits CD14-TLR4 signal transduction in polarized macrophagesNote: Phosphorylation of RAF-1,MEK,p42/p44 ERK were assessed immunoblotting and an internal control.Representative immuno-blotting is shown for three experiments.

2.4C1INH抑制極化巨噬細(xì)胞CD14-TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) CD14參與LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路，導(dǎo)致胞內(nèi)Raf-1/MEK/ERK激活[17,18]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：通過(guò)Western blot證實(shí)C1INH抑制LPS誘導(dǎo)M1和M2的Raf-1/MEK/ERK (p44/42)的磷酸化的作用(圖5)。結(jié)果提示：C1INH具有抑制LPS誘導(dǎo)CD14-TLR4介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路激活的作用。

3 討論

C1INH是一個(gè)急性時(shí)相蛋白，是一種蛋白酶的抑制物,在患者致命感染性休克時(shí)，C1INH水平趨于正常的，但滅活的C1INH則增加，尤其感染性炎癥區(qū)C1INH水平可增加2.5倍。在C1INH缺乏，補(bǔ)體系統(tǒng)和相應(yīng)的激肽系統(tǒng)功能狀態(tài)就受影響[19-22]。已有研究證明，C1INH可減少細(xì)胞因子對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)激活的作用[23]。我們以前已證實(shí)：C1INH抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞系RAW264.7的TNF-α mRNA表達(dá)[10]，C1INH抑制血液中或腹膜液中活細(xì)菌的生長(zhǎng)，可通過(guò)增加中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌吞噬功能和殺細(xì)菌作用[11]。

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可表達(dá)補(bǔ)體受體CR1(CD35)、CR3(CD11b/CD18)和CR4(CD11c/CD18)。 補(bǔ)體成分可與巨噬細(xì)胞多種補(bǔ)體受體相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[9]。IFN-γ誘導(dǎo)表型CD14的表達(dá)是M1的標(biāo)記物，IL-4+IL-13誘導(dǎo)表型CD163的表達(dá)是M2的標(biāo)記物[5]。在GM-CSF源性M2，CD206表型是增高的。CD206也可高表達(dá)在人單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞上[24]。 在一些類(lèi)似M2的細(xì)胞中，也可有表型CD206和CD163表達(dá)，呈現(xiàn)是一種抗炎表型的表達(dá)，但也能分泌一些促炎介質(zhì)[25]。但在某些疾病中，如哮喘患者，其M2的表型CD163的表達(dá)就比非哮喘正常巨噬細(xì)胞的表達(dá)較少[26]。

4 結(jié)論

在本研究中，C1INH對(duì)極化巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)如下：①調(diào)節(jié)極化巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD14、CD163、CD206再分布；②調(diào)節(jié)極化巨噬細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞因子分泌和相關(guān)酶表達(dá)的改變；③增強(qiáng)極化巨噬細(xì)胞殺菌活性和對(duì)菌吞噬功能；④抑制CD14-TLR4介導(dǎo)信號(hào)通路途徑。因此，C1INH調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，可能成為一種潛在的治療炎癥反應(yīng)新藥物。