■侍寶路 王計偉劉春雪 孫海林 王二柱 胡丹丹

(安佑生物科技集團股份有限公司，江蘇太倉215437)

在我國豆渣是一種常見的食品副產(chǎn)物，其水分高（80%左右），產(chǎn)量大（2 000萬噸/年）[1]。豆渣中富含膳食纖維、微量元素、維生素B1等，是良好的飼料原料[2]。但未經(jīng)處理的新鮮豆渣適口性差，不易貯存，除少部分作為飼料使用外，大部分豆渣被直接丟棄造成環(huán)境污染[3]。通過微生物發(fā)酵的方式有效改善新鮮豆渣的適口性，提高其貯藏性能和營養(yǎng)價值，在畜禽養(yǎng)殖中具有現(xiàn)實意義。

有學者通過利用霉菌和酵母菌發(fā)酵分解豆渣中的纖維素等多糖生產(chǎn)蛋白飼料[4-6]。辜瀾濤等使用乳酸菌、酵母菌和枯草桿菌復(fù)合菌劑發(fā)酵豆渣，粗蛋白含量由發(fā)酵前的19.76%提高為28.06%[7]。張永根等向豆渣中添加乳酸菌和枯草芽孢桿菌，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓袡C酸、耐貯存的反芻飼料[8]。張文佳等通過白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵豆渣，改善其適口性并提高了貯存性能[9]。

酸化飼料通常是在飼料中添加酸化劑，降低飼料的pH值，在達到防霉效果的同時可以提高飼養(yǎng)效益[10]，提高豬尤其是幼齡仔豬的腸道健康[11]。豆渣中含有較高的纖維素，限制了適口性和使用量，關(guān)于通過發(fā)酵降解豆渣中中性洗滌纖維（NDF）并提高其酸度的研究尚未見報道。因此本試驗以豆渣為原料，添加麩皮為輔料，利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵改善其適口性并降低物料的pH值，降低NDF含量，將其變成耐貯存、適口性強的酸化飼料，用于提高動物腸道健康。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

原料：豆渣（來自于江蘇省太倉市彬彬豆業(yè)食品有限公司）。

輔料：麩皮（購于江蘇省太倉市某農(nóng)貿(mào)市場）。

1.1.2 試驗菌種

乳酸菌：安佑研究院微生物研究所菌種庫乳酸菌5株（編號：X-1、X-2、X-3、X-4、X-5），具有甘油管和固體菌粉制劑兩種形式，5種固體菌粉制劑為經(jīng)生產(chǎn)調(diào)配后濃度相同，且活菌數(shù)均大于1×109cfu/g。

釀酒酵母：來自安佑研究院微生物研究所，菌粉活菌數(shù)大于1×108cfu/g。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：濕豆渣與麩皮按7∶3比例混合后水分約為60%的發(fā)酵物料。

MRS液體培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基：購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 高產(chǎn)酸乳酸菌株篩選

將5株乳酸菌甘油管接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8～10 h，活菌數(shù)達到大于109cfu/ml為止。

1.2.1.1 初篩

① 溶鈣圈法：將活化好的菌液接種于100 ml MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h；使用牛津杯法測量溶鈣圈直徑大小，牛津杯中加入250 μl菌液[12]，每個菌株做3個重復(fù)。

②酸堿滴定法[12]：

將活化好的菌液接種于100 ml MRS液體培養(yǎng)基中，恒溫靜置培養(yǎng)48 h，取1 ml發(fā)酵液稀釋消除底色干擾，以1%酚酞作指示劑，用0.1 mol/l的NaOH溶液滴定至為微紅色，每個菌株做3個重復(fù)。酸度以100 ml發(fā)酵液消耗的NaOH的摩爾數(shù)來表示：

式中：CNaOH——NaOH標準溶液的摩爾濃度(0.1 mol/l)；VNaOH——滴定所用的NaOH標準溶液的體積(L)。篩選出鈣溶圈較大且酸度較強的3株乳酸菌進入復(fù)篩。

1.2.1.2 復(fù)篩

進入復(fù)篩的乳酸菌菌種，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝調(diào)配后濃度相同，且活菌數(shù)均大于1×109cfu/g。取一定量固體培養(yǎng)基，分別接種進入復(fù)篩的乳酸菌菌粉制劑，接種量均為2‰，混勻后裝進發(fā)酵袋中，排出空氣將袋口扎緊，模擬養(yǎng)殖場的發(fā)酵密封條件，36℃發(fā)酵72 h，每個處理3個重復(fù)，測定發(fā)酵后物料中總酸含量，來確定產(chǎn)總酸最多的1株乳酸菌。

1.2.2 乳酸菌與酵母菌混合比例的確定

1.2.3 正交試驗設(shè)計篩選最佳發(fā)酵條件組合

采用乳酸菌和釀酒酵母菌在上述試驗中得到的最佳配方比例，選擇接種量（A）、含水量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）為考察因素，每個因素設(shè)定3個水平，以發(fā)酵產(chǎn)物的活菌數(shù)和pH值作為綜合考察指標，進行L9(34)正交試驗，試驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗的因素水平設(shè)計

1.2.4 最佳發(fā)酵條件下物料的營養(yǎng)成分在發(fā)酵前后的變化

通過單因素篩選試驗和正交試驗得到的最佳發(fā)酵條件，在此條件下得到發(fā)酵產(chǎn)物，在物料質(zhì)地、pH值、總酸、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量等方面比較發(fā)酵前后的變化。

1.3 方法

1.3.1 飼料營養(yǎng)成分的測定

飼料中的水分、總酸和粗蛋白質(zhì)含量測定分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—1994和GB/T 12456—2008方法；中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）參照Van Soest等[13]方法進行測定；pH值采用PHS-3C型酸度計直接測定。

1.3.2 活菌數(shù)的測定

牙周-牙髓聯(lián)合病變涉及牙周、牙髓及根尖周組織，三者互相影響且可呈現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)，其中Ⅰ型牙周-牙髓聯(lián)合病變主要是由牙髓及根尖周病引起的牙周病變[1-2]。若牙周-牙髓聯(lián)合病變病程持續(xù)時間較長，則易導(dǎo)致牙槽骨缺損；經(jīng)完善的根管治療及牙周治療后，牙周病變可得到明顯改善，而牙周組織的破壞能否較好的修復(fù)則有待觀察[3]。近年來，再生性牙周手術(shù)的應(yīng)用越來越普遍，主要包括引導(dǎo)性組織再生術(shù)(Guided tissue regeneration, GTR)及植骨術(shù)[4]。本研究對Ⅰ型牙周-牙髓聯(lián)合病變患牙進行GTR聯(lián)合骨移植術(shù)，以探討其對牙周組織病變修復(fù)治療的有效性。

乳酸菌總數(shù)和酵母菌總數(shù)測定分別參照GB 4789.35-2016和GB 4789.15-2016方法。

1.3.3 乳酸菌與酵母菌混合比例的確定

以本試驗總酸和ΔNDF含量（NDF降解量）為考察指標，予不同的權(quán)重系數(shù)，總酸和ΔNDF含量分別為0.5和0.5，再進行加權(quán)評分，綜合評分（OD）=0.5A/Amax+0.5B/Bmax，（A為總酸含量，B為ΔNDF含量）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵原料的營養(yǎng)成分

發(fā)酵原料為新鮮豆渣與麩皮按7∶3比例混合，其常規(guī)營養(yǎng)成分如表2所示。

表2 發(fā)酵原料的常規(guī)營養(yǎng)指標

2.2 高產(chǎn)酸乳酸菌株初篩

對5株乳酸菌進行溶鈣圈試驗，牛津杯中發(fā)酵菌液含有的有機酸和培養(yǎng)過程中乳酸菌生長代謝產(chǎn)生有機酸，滲透到含有1%CaCO3培養(yǎng)基中，形成透明圈。在充足的時間內(nèi)產(chǎn)酸量不同，形成的溶鈣圈大小不同。溶鈣圈測量結(jié)果如表3所示。

表3 溶鈣圈測量結(jié)果

采用酸堿滴定法測定5株乳酸菌的發(fā)酵酸度，結(jié)果見圖1。菌株X-1、X-2和X-3的發(fā)酵酸度較高，且驗證了溶鈣圈法結(jié)果，因此進入復(fù)篩的3株乳酸菌為：X-1＞X-2＞X-3。

圖1 各菌株產(chǎn)酸量

2.3 高產(chǎn)酸乳酸菌株復(fù)篩（見表4）

由表4可以看出，以新鮮豆渣為原料，麩皮為輔料，接種進入復(fù)篩的乳酸菌，恒溫厭氧發(fā)酵后，菌株X-2發(fā)酵產(chǎn)生總酸最多，因此菌株X-2為本試驗產(chǎn)酸量高的乳酸菌株，為植物乳桿菌。

表4 3株乳酸菌發(fā)酵豆渣中總酸含量（絕干基計）

2.4 植物乳酸菌與釀酒酵母菌混合比例的確定（見表5）

表5 兩種菌株以不同比例發(fā)酵后綜合評分

由表5可以看出，混合比例為50∶50時綜合評分OD最高，能夠有效降解物料中NDF的同時產(chǎn)生更多的有機酸。

2.5 正交試驗結(jié)果

選定植物乳桿菌和釀酒酵母菌復(fù)合比例為50∶50，按照正交試驗設(shè)計的因素水平試驗，測定各因素水平下活菌數(shù)和pH值，其結(jié)果見表6。由試驗結(jié)果可以看出最佳的試驗組合為A1B3C3D3，即最佳工藝條件：接種量為2‰，發(fā)酵原料含水量為70%，發(fā)酵溫度為36℃，發(fā)酵時間為72 h。

表6 正交試驗結(jié)果與分析

2.6 發(fā)酵前后物料的感官指標和部分營養(yǎng)指標變化(見表7)

由表7可知，物料經(jīng)發(fā)酵后由原來的豆腥味變?yōu)榘l(fā)酵酸香氣味，NDF含量由49.65%降為36.09%，總酸含量由1.19%增加為3.45%，發(fā)酵后物料pH值由6.44降為3.75，適口性大大提高，酸性條件下有利于儲存。

表7 發(fā)酵前后部分營養(yǎng)參數(shù)的比較

3 討論

3.1 高產(chǎn)酸乳酸菌篩選

由于新鮮豆渣濕度較大，若暴露在空氣中，易造成霉菌和一些好氧細菌的生長繁殖，其溫度及pH值隨之升高，新鮮豆渣開始腐敗，影響豆渣的保質(zhì)期[14]。而在新鮮豆渣中接種乳酸菌，通過密閉厭氧發(fā)酵，迅速生長繁殖成為優(yōu)勢菌群，同時產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸，降低物料的pH值，抑制腐敗微生物菌群的生長繁殖，達到保鮮的目的[15]。有研究發(fā)現(xiàn)有機酸通過改變致病菌細胞膜電位達到抑菌的效果[16]；同時改變有害微生物生存環(huán)境的pH值，抑制其生長繁殖[17]。因此，為了延長發(fā)酵豆渣的保質(zhì)期，應(yīng)篩選出產(chǎn)酸量高的乳酸菌。由試驗結(jié)果比較5株乳酸菌的產(chǎn)酸能力，以豆渣為發(fā)酵基質(zhì)時，植物乳桿菌為高產(chǎn)酸乳酸菌株。

3.2 植物乳桿菌與釀酒酵母菌混合比例的確定

為了模擬養(yǎng)殖場的厭氧發(fā)酵條件，將發(fā)酵袋排除空氣后扎緊袋口，未經(jīng)抽真空處理，故在發(fā)酵過程中發(fā)酵袋并非嚴格厭氧。植物乳桿菌為耐氧性厭氧菌，微氧環(huán)境并不影響它的生長繁殖[18]。酵母菌有氧條件下代謝產(chǎn)生風味有機酸[19]和厭氧條件下產(chǎn)生乙醇，均可改善豆渣的風味。酵母菌擁有豐富的酶系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生淀粉酶、內(nèi)生葡聚糖酶、內(nèi)生糖苷酶、木聚糖酶等。通過兩種菌株的混合發(fā)酵降低豆渣中的NDF含量，一方面降低物料的pH值，延長保質(zhì)期；另一方面發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸、乙醇及一些風味物質(zhì)明顯改善豆渣的適口性，而纖維含量與適口性有很大關(guān)系，常用NDF含量來表示[20]。綜合評價是根據(jù)多項試驗結(jié)果的重要性，確定每項所占的權(quán)重，將多項試驗結(jié)果化為單項試驗結(jié)果，以求得其優(yōu)劣等級的一種評價方法[21]。試驗通過發(fā)酵后豆渣的NDF降解量和總酸含量的綜合評分（OD）來確定最佳的發(fā)酵比例。由試驗結(jié)果可以看出，乳酸菌與酵母菌混合最佳比例為50∶50。

3.3 正交試驗結(jié)果

對于混菌發(fā)酵技術(shù)而言，接種量、含水量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度等因素相互影響，對發(fā)酵效果有重要影響。接種量的大小影響著發(fā)酵菌種的生長繁殖速度，加大接種量可以使發(fā)酵菌短時間內(nèi)成為優(yōu)勢菌群，減少雜菌污染，提高發(fā)酵效果。考慮實際生產(chǎn)成本，為使發(fā)酵效益最大化，選擇最合適的接種量是發(fā)酵的關(guān)鍵。由試驗結(jié)果可以看出，選取A1為該因素的最佳水平，即最適宜的接種量為2‰。

提高物料的起始含水量，可增加水解酶的產(chǎn)生并促進其擴散；同時提高物料營養(yǎng)物質(zhì)的利用和減少代謝產(chǎn)物對發(fā)酵菌種的抑制作用，有助于發(fā)酵菌種的生長代謝[22-23]。本試驗結(jié)果中顯示B3為該因素最佳水平，即發(fā)酵原料最佳含水量為70%，與前人研究結(jié)果相符。

發(fā)酵溫度影響微生物生長代謝相關(guān)的酶活，影響代謝產(chǎn)物的形成和發(fā)酵效果[24]，所以要嚴格控制發(fā)酵溫度。試驗所用釀酒酵母與乳酸菌的最適培養(yǎng)溫度不同，由試驗結(jié)果看出，C3為該因素最佳水平，即發(fā)酵溫度為36℃。

發(fā)酵時間是確定發(fā)酵是否可結(jié)束的時間點。發(fā)酵時間過短，會導(dǎo)致發(fā)酵底物未被充分利用，未到達預(yù)期效果，發(fā)酵時間過長，導(dǎo)致物料損耗過多，發(fā)酵成本增加，并增加了發(fā)酵物料染菌幾率。本試驗結(jié)果選取D3為該因素的最佳水平，即最佳發(fā)酵時間為72 h。

3.4 發(fā)酵后部分營養(yǎng)參數(shù)的變化

通過正交試驗得到最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵豆渣，產(chǎn)物由原來的豆腥味變?yōu)榘l(fā)酵酸香味，且后期隨著貯存時間的延長，釀酒酵母持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的酒香氣味更加濃郁。豆渣經(jīng)發(fā)酵后，NDF含量下降了27%，總酸含量提高了1.9倍，pH值降為3.75。發(fā)酵的酸性條件有利于抑制雜菌生長，延長貯存時間，張永根等研究，利用復(fù)合乳酸菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆渣與麩皮混合物，可降低其pH值，延長其貯藏時間[8]，與本試驗結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本試驗采用植物乳桿菌和釀酒酵母菌混合固態(tài)發(fā)酵豆渣，最佳發(fā)酵工藝條件為：接種量2‰，含水量70%，發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時間72 h。在最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵底物NDF含量為36.09%，比發(fā)酵前下降了27%，總酸含量為3.45%，比發(fā)酵前提高了1.9倍，pH值降為3.75，使其成為一種低pH值、耐貯存并有助于提高動物腸道健康的新鮮飼料原料，且此發(fā)酵方案在養(yǎng)殖場具有實際操作性。