羅青春 ，趙 東 ，2，喬宗偉 ，2，鄭 佳 ，2

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007； 2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644007)

濃香型白酒作為四大香型白酒之一，在我國(guó)白酒行業(yè)中占有舉足輕重的地位。眾所周知，白酒品質(zhì)及風(fēng)格往往是由各種風(fēng)味物質(zhì)的含量與比例關(guān)系所決定。優(yōu)質(zhì)濃香型白酒中，四大酯類(lèi)的比例為己酸乙酯＞乳酸乙酯＞乙酸乙酯＞丁酸乙酯[1]。而雜醇油是白酒中最重要的三大芳香組分之一，是3個(gè)碳以上的一元醇類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，其主要成分是正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等高級(jí)醇[2]。但是，如果白酒中雜醇油含量過(guò)高，對(duì)人體有毒害作用，它對(duì)人體的中毒和麻醉作用比乙醇強(qiáng)，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，使人感覺(jué)頭疼。它還是白酒苦味和澀味的主要來(lái)源之一，同時(shí)也是造成白酒出現(xiàn)白色渾濁的原因之一[3-4]。

目前研究中，關(guān)于降解正丙醇的報(bào)道非常少，羅惠波等[5]通過(guò)在大曲中添加糖化酶，結(jié)果正丙醇含量隨糖化酶增加有小幅度的增加，可能是由于糖化酶能把淀粉從非還原性末端水解斷裂α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，而添加糖化酶后，加速了淀粉水解速度，使可被酵母直接利用的葡萄糖濃度增加，酵母會(huì)加速對(duì)糖分的代謝，而減少了對(duì)氨基酸的降解代謝，降低了正丙醇的產(chǎn)生量。而關(guān)于正丙醇降解菌的篩選還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究從窖泥中篩選出1株正丙醇降解菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA測(cè)序分析鑒定為放線菌中的原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)。這對(duì)濃香型白酒降低雜醇油提供了一種新的菌株，也對(duì)放線菌在窖泥中的功能有了新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 窖泥

實(shí)驗(yàn)樣品采集：樣品取自宜賓五糧液股份有限公司窖齡為20年窖池的窖底泥，窖池分別在窖底4個(gè)角落和接近中心點(diǎn)的一點(diǎn)各取1個(gè)樣，每個(gè)樣品重量約100 g，在無(wú)菌袋中混勻后立即使用。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：NaCl 1.0 g、K2HPO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、MgCl20.5 g、NaNO31.0 g、葡萄糖 2 g，溶于500 mL蒸餾水中，酒糟20 g、黃水10 mL、曲粉6 g、酒尾20 mL，溶于500 mL蒸餾水中攪動(dòng)半小時(shí)后用8層紗布過(guò)濾，再混合后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、6.67 g/L CaCl23.0 mL、17 g/L FeCl33.0 mL、Fe-SO4·7H2O 0.05 g、NaNO31.0 g、不同濃度正丙醇(唯一碳源)、1000 mL蒸餾水。

保藏培養(yǎng)基：MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、NH4Cl 1.0 g、6.67 g/L CaCl23.0 mL、17 g/L FeCl33.0 mL、FeSO4·7H2O 0.05 g、NaNO31.0 g、酵母浸粉 2.0 g、1000 mL蒸餾水。

1.1.3 試劑與儀器

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物)，SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒(上海生工生物)，氣相色譜儀(Agilent)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正丙醇降解菌的篩選

1.2.1.1 富集培養(yǎng)

將窖泥樣品，以5%的接種量接種于含正丙醇4 g/L的富集培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)15 d。

1.2.1.2 初步篩選

把富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⑼坎加跓o(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板，挑取10株單菌落劃線純化，并接入無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)15 d，0.2 μm濾膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)[6]。

1.2.2 正丙醇降解菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察試驗(yàn)

對(duì)平板劃線的單菌落進(jìn)行形態(tài)觀察。革蘭氏染色包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等4個(gè)步驟，具體操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

DNA提?。簩⒑Y選的降解效果最好的菌株接入保藏培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)15 d，取1 mL菌液以10000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體，按生工生物細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(B518225)提取DNA，-20℃保藏備用。

PCR擴(kuò)增：利用引物27F和1492R對(duì)細(xì)菌基因組16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。擴(kuò)增體系(25μL)：10×PCR buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol/L each)1 μL，DNA10 ng，引物 F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。

16S rDNA序列測(cè)定：利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化；純化產(chǎn)物的測(cè)序工作由上海生工生物有限公司完成。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建：將所測(cè)定的細(xì)菌16S rDNA基因序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn和RDP Classifier相似性分析，選取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系相對(duì)較近的標(biāo)準(zhǔn)菌株用Clustalw軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 正丙醇降解菌培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)

挑選正丙醇降解效果最好的1株菌MBM-7，即降解率最高，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以培養(yǎng)溫度、pH值和正丙醇含量為主要參數(shù)，采用L9(33)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，接種量5.0%，靜置培養(yǎng)3 d，條件如表1所示進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)因素與水平

降解率計(jì)算：

式中：R為降解率，%；A為空白樣正丙醇濃度，%；B為試驗(yàn)樣正丙醇濃度，%。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用軟件SPSS 22對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

將窖泥的稀釋菌液涂布在正丙醇濃度分別為1 g/L、2 g/L和4 g/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，均能生長(zhǎng)出菌落。從正丙醇濃度為4 g/L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上挑取10株菌，在30℃、15 d厭氧培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)濾及氣相色譜測(cè)定后，篩選出了降解效果最好的菌株MBM-7，其降解率為37.0%(空白組正丙醇含量為3.99 g/L，試驗(yàn)組正丙醇含量為2.51 g/L)。

2.2 菌株MBM-7形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 MBM-7形態(tài)觀察結(jié)果

經(jīng)觀察MBM-7革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀（圖1A）；菌落呈白色、表面光滑濕潤(rùn)、中間凸起、邊緣整齊（圖1B），2.0～2.3 μm×2.1～2.5 μm。

圖1 MBM-7菌體及菌落形態(tài)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

GenBank登錄號(hào)是MH256113，將菌株16S rDNA序列與GenBank上的其他16S rDNA序列進(jìn)行Blast分析，做進(jìn)化樹(shù)(圖2)比較結(jié)果顯示，菌株MBM-7與Arthrobacter protophormiaestrain DSM 20168(NR_026195)相似性為99.9%，將該菌鑒定為放線菌目下的原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)。經(jīng)RDP進(jìn)行分類(lèi)，其分類(lèi)地位為：放線菌綱(Actinobacteria)、放線菌目(Actinomycetales)、微球菌科(Micrococcaceae)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)。

2.3 菌株MBM-7培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由于培養(yǎng)溫度，pH值等條件會(huì)影響其降解效果，因此需進(jìn)一步優(yōu)化其培養(yǎng)條件。以培養(yǎng)溫度、正丙醇含量和pH值3因素進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。該實(shí)驗(yàn)極差R可知，3種因素對(duì)菌株MBM-7正丙醇降解率的影響主次因素為B＞C＞A，即正丙醇濃度＞pH值＞溫度，同時(shí)，比較同一因素在不同水平下所對(duì)應(yīng)正丙醇降解率的大小，從而得知本試驗(yàn)的最佳水平組合為A2B1C3。因此最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度32℃、正丙醇終濃度0.1%、pH7，降解率達(dá)到91.2%。

圖2 MBM-7菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖

根據(jù)表3中3因素對(duì)菌株MBM-7正丙醇降解率的影響進(jìn)行了方差分析，3個(gè)因素的F值由大到小依次為正丙醇濃度、pH值、溫度，說(shuō)明正丙醇濃度對(duì)菌株降解正丙醇的影響力最大，其次是pH值，影響最小的是溫度。

表2 L9(33)正丙醇降解菌MBM-7的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 討論

目前關(guān)于濃香型白酒窖泥放線菌的報(bào)道還較少，劉茂柯等[8]利用PCR-DGGE研究了窖泥放線菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，表明窖泥放線菌歸于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4個(gè)屬，Olsenella、Atopobium優(yōu)勢(shì)隨窖齡延長(zhǎng)而升高。裴樂(lè)樂(lè)等[9]利用熒光定量PCR研究了不同窖齡窖泥放線菌，發(fā)現(xiàn)隨著窖齡的延長(zhǎng)，放線菌數(shù)量隨之增加。此外，王濤等[10]從窖泥中分離到的Streptomyces屬的多株放線菌可產(chǎn)酯、酸、醛、酮和醇類(lèi)等濃香型白酒中的重要呈香呈味物質(zhì)。但是，至今還未見(jiàn)有關(guān)濃香型白酒節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）的相關(guān)報(bào)道。

本研究從窖泥中篩選出了1株正丙醇降解菌，經(jīng)形態(tài)特征、16S rDNA序列分析，鑒定菌株MBM-7為放線菌中的原玻璃蠅節(jié)桿菌（A.protophormiae），系國(guó)內(nèi)首次分離到了降解正丙醇的放線菌。從窖泥中篩選分離到的正丙醇降解菌MBM-7，通過(guò)正丙醇降解條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，MBM-7的最適降解條件為：培養(yǎng)溫度32℃、初始正丙醇終濃度0.1%、pH 7，在該條件下，正丙醇的降解率達(dá)到91.2%。

Labana等[11-13]研究表明，A.protophormiae能夠?qū)ξ廴镜耐寥肋M(jìn)行生物修復(fù)。但是，至今還未見(jiàn)有關(guān)濃香型白酒節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)的相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)分離到正丙醇降解菌MBM-7放線菌的研究可能存在較大的應(yīng)用前景。放線菌是窖泥中棲息的功能微生物菌群，并且對(duì)正丙醇具有顯著的降解作用，這為濃香型白酒“降雜醇油”方面的研究提供了一種新的菌株，也對(duì)放線菌在窖泥中的功能有了新的認(rèn)識(shí)。