王秋平

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南衡陽 421001)

濫用抗生素的問題由來已久，2000年出現(xiàn)了多重耐藥假單胞菌和肺炎克雷伯菌。2010年8月The Lancet Infectious Diseases雜志報道了抗生素抗新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(NDM-1)超級細(xì)菌。NDM-1是一種新鑒定的對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有廣譜水解作用的酶，是編碼碳青霉烯類酶基因家族成員之一。NDM-l可以水解碳青霉烯類抗生素，以及頭孢菌素和青霉素。攜帶該基因的細(xì)菌對幾乎所有一線治療重癥感染的廣譜抗生素，如青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β-內(nèi)酰胺和碳青霉烯類抗生素均耐藥，僅對多黏菌素E及米諾環(huán)素衍生物——替加環(huán)素敏感，被稱為“超級細(xì)菌”[1-2]。由于這類細(xì)菌的廣譜耐藥特性，有必要進(jìn)行早期快速鑒定，從而為控制醫(yī)院內(nèi)感染和臨床治療提供及時準(zhǔn)確的指導(dǎo)[3]。傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥基因檢測通常采用細(xì)菌分離培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)[3]，這些方法雖然有效，但由于檢測時間較長，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測，臨床工作中急需快速有效的NDM-1陽性細(xì)菌鑒定方法。采用毛細(xì)管聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑可以簡化操作并縮短分析時間，滿足快速檢測的需要。本研究采用直接PCR擴(kuò)增試劑MightyAmp DNA Polymerase，嘗試將直接PCR擴(kuò)增與微流控芯片電泳技術(shù)結(jié)合用于NDM-1陽性細(xì)菌快速鑒定，擬建立一種快速、高靈敏的檢測方法，實(shí)現(xiàn)早期指導(dǎo)臨床用藥和控制醫(yī)院內(nèi)感染，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 (1)標(biāo)本來源：收集本院2016-2017年對碳青霉烯類抗生素不敏感的80株腸道桿菌(美羅培南MIC≥2 μg/mL)和60株鮑曼不動桿菌(亞胺培南MIC≥64 μg/mL)。所有菌株使用法國梅里埃公司VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定藥敏分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)檢測。以大腸埃希菌ATCC 25922及銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質(zhì)量控制菌株。(2)引物設(shè)計：根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]按基因序列(FN396876)設(shè)計PCR特異引物序列，上游：5′-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3′，下游：5′-CGCAACACA GCCTGACTTTC-3′，擴(kuò)增片段長度286 bp。PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2試劑與儀器 寶生物工程(大連)有限公司的MightyAmp DNA Polymerase試劑盒，DL2000 DNA Marker，瓊脂糖。江蘇興化宏泰硅氟制品廠的聚四氟乙烯毛細(xì)管，美國Bio-Rad公司MyCycler PCR擴(kuò)增儀、電泳儀，英國UVI公司凝膠成像分析儀和紫外分析儀。美國貝克曼庫爾特公司臺式冷凍離心機(jī)，法國梅里埃公司VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定藥敏分析儀。研究采用塑型十字架結(jié)構(gòu)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)電泳芯片[4]，芯片的有效分離通道長度設(shè)定為4 cm，電泳分析激光誘導(dǎo)在熒光芯片分析儀上完成。該儀器由芯片電泳平臺、光學(xué)檢測系統(tǒng)、高壓電源控制和操作軟件組成，檢測方式為共聚焦激光誘導(dǎo)熒光。毛細(xì)管PCR裝置參考文獻(xiàn)[4-5]。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)NDM-1細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室篩查和表型確認(rèn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法，(1)按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會的改良方法進(jìn)行，制備菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫?，采用無菌棉簽取已制備好的菌液，在水解酪蛋白(M-H)瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周。平板置室溫干燥3～5 min后用無菌鑷子取美羅培南(10 μg)和亞胺培南(10 μg)紙片，檢測美羅培南和亞胺培南的抑菌環(huán)直徑。(2)乙二胺四乙酸(EDTA)協(xié)同試驗(yàn)篩選金屬酶表型，0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌涂布M-H平板，貼2張亞胺培南紙片，相距1.0～1.5 cm，其中一張紙片上面滴加0.5 mol/L EDTA 10 μL。35 ℃過夜培養(yǎng)，亞胺培南加EDTA與亞胺培南紙片抑菌圈之差≥5 mm者為金屬酶陽性。

1.3.2產(chǎn)NDM-1細(xì)菌基因診斷 采用常規(guī)PCR檢測，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系分別是MightyAmp DNA Polymerase酶0.5 μL，MightyAmp PCR Buffer12.5 μL，引物F(10 μmol/L)1.0 μL，引物R(10 μmol/L)1.0 μL，ddH2O 8.0 μL，菌液標(biāo)本2.0 μL，總體積25.0 μL。在臺式PCR儀上反應(yīng)條件98 ℃，2 min,98 ℃ 10 s，68 ℃ 10 s 40個循環(huán)。高效振蕩流毛細(xì)管PCR檢測：毛細(xì)管PCR反應(yīng)體系同上，毛細(xì)管PCR反應(yīng)條件：將上述PCR反應(yīng)液振蕩，充分混勻，毛細(xì)管PCR裝置中毛細(xì)管順序吸入5 μL礦物油和3 μL PCR反應(yīng)液。液滴首先運(yùn)動至98 ℃區(qū)停留2 min，繼而在98 ℃和68 ℃區(qū)間往返運(yùn)動40個循環(huán)。液滴運(yùn)動速度為120 μL/min，每個循環(huán)在68 ℃區(qū)暫停10 s。毛細(xì)管PCR產(chǎn)物檢測同上。PCR產(chǎn)物的電泳分析，瓊脂糖電泳分析，配制2%瓊脂糖凝膠板，按試劑標(biāo)準(zhǔn)操作配置2%的瓊脂糖凝膠。取DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)液(DL2000)5 μL，直接上樣。電泳儀電壓為100 V，約30 min后停止電泳。置于UV紫外分析儀下觀察并照相，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長度得出判斷結(jié)果。微流控芯片電泳分析：用實(shí)驗(yàn)室自制的激光誘導(dǎo)熒光芯片分析儀檢測。將PCR產(chǎn)物用無菌雙蒸水稀釋20倍。先利用真空泵讓電泳緩沖液各10 μL灌滿通道，同時將10 μL稀釋后的樣品加入樣品池中。用1.2%HPMC作為篩分介質(zhì)，緩沖液為1×PCR Buffer，電泳分離電壓為1.2 kV，分離時間設(shè)定為300 s。采用50～800 bp DNA ladder Marker和待測PCR產(chǎn)物按1∶1比例在相同條件下進(jìn)行芯片電泳，根據(jù)500 bp DNA ladder Marker和內(nèi)標(biāo)物(50 bp和800 bp DNA片段)的相對遷移時間確定待測樣品中特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段。微流控芯片利用DNA電泳分析，通過比較待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的遷移時間確定DNA片段大小。

1.3.3微流控芯片法檢測NDM-1耐藥菌敏感度 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù)-平板涂布計數(shù)法:將耐藥菌接種于新鮮血平板上，培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)好的單個菌落從血平板上刮下來，溶于2 mL 0.45%的無菌鹽水中，充分振蕩混勻；分別在24個EP管內(nèi)加入900 μL無菌生理鹽水，排成3排，按順序編號。從前面配好的菌液中取出100 μL加到第1個EP管內(nèi)，則第1個EP管內(nèi)細(xì)菌濃度為標(biāo)本的1/10；同法，從第1個EP管中取出100 μL加到第2個EP管內(nèi)，則第2個EP管內(nèi)細(xì)菌濃度為標(biāo)本的1/100。依此類推，第8個EP管細(xì)菌濃度為原標(biāo)本的1/108。制備好營養(yǎng)培養(yǎng)基，高壓消毒滅菌。將培養(yǎng)基溶解，待冷卻50 ℃左右，倒入平板。取稀釋好的菌液1 mL鋪皿。35 ℃培養(yǎng)24～28 h后，看平皿上菌落數(shù)。選取細(xì)菌數(shù)量在30～300的菌液濃度進(jìn)行計數(shù)。原菌液標(biāo)本每毫升的細(xì)菌濃度=某一濃度3個平板的菌落總數(shù)/3×10(該濃度菌液的稀釋倍數(shù))(CFU/mL)。敏感度考察：將已經(jīng)涂布平板中的原菌液標(biāo)本按107、106、105、104、103、102、101、100梯度稀釋，分別作為PCR模板，PCR反應(yīng)體系和循環(huán)條件同前?？疾烀夂怂崽崛CR的敏感度。

1.3.4測序驗(yàn)證 將免核酸提取PCR產(chǎn)物送大連寶生物進(jìn)行測序，用chromas145軟件進(jìn)行分析，并在Pub Med上與FN396876.1序列進(jìn)行比對。

1.4方法學(xué)評價及臨床標(biāo)本檢測 對毛細(xì)管液滴PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分析評價該方法的特異度和敏感度；本研究采用碳青霉烯類酶陽性K-B紙片法和毛細(xì)管PCR結(jié)合微流控芯片電泳對本院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室2016-2017年收集的80株耐藥腸道桿菌(美羅培南MIC≥2 μg/mL)和60株鮑曼不動桿菌(亞胺培南MIC≥64 μg/mL)耐藥菌進(jìn)行篩查，并對耐藥菌標(biāo)本進(jìn)行NDM-1基因檢測。

2 結(jié) 果

2.1不同酶濃度對毛細(xì)管液滴PCR效果的影響 本試驗(yàn)比較4種酶用量，加入MightyAmp DNA Polymerase酶分別是0.1、0.3、0.5、0.7 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶的濃度與毛細(xì)管液滴PCR效果隨酶濃度的增加而升高，當(dāng)酶加入量為0.5 μL時趨向于飽和，因此，本試驗(yàn)酶加入量以0.5 μL為最優(yōu)，見圖1。

圖1 試驗(yàn)酶加入量對PCR的影響

2.2不同標(biāo)本量對毛細(xì)管液滴PCR效果的影響 為了考察MightyAmp DNA Polymerase酶的最合適檢測標(biāo)本體積，將不同菌液體積(1、2、3、5、7 μL)進(jìn)行毛細(xì)管PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn),標(biāo)本加入量到5 μL時，PCR效率有所下降；當(dāng)標(biāo)本加入量為7 μL時，PCR受到明顯抑制，并且有纖維凝固團(tuán)產(chǎn)生,見圖2。因此，最合適檢測標(biāo)本的體積為2 μL。

圖2 標(biāo)本量對毛細(xì)管液滴PCR的影響

2.3不同退火溫度和延伸時間對毛細(xì)管液滴PCR效果的影響 為了考察在毛細(xì)管液滴PCR上退火溫度和延伸時間對PCR效果的影響，將同一陽性標(biāo)本采用同樣的PCR反應(yīng)體系，退火溫度分別為62、65、68、71、74 ℃，比較芯片電泳熒光信號強(qiáng)弱。發(fā)現(xiàn)芯片電泳熒光信號退火溫度為68 ℃較強(qiáng)，但不是最理想。每個循環(huán)中在68 ℃區(qū)暫停10 s，將退火和延伸加長，從而延長反應(yīng)時間，芯片電泳熒光信號達(dá)最大值，PCR擴(kuò)增效果相當(dāng)成功，見圖3、4。

圖3 退火溫度對毛細(xì)管PCR的影響

圖4 延伸時間對毛細(xì)管PCR的影響

2.4臨床耐藥菌篩選、表型確認(rèn)及毛細(xì)管PCR微流控芯片電泳結(jié)果 EDTA協(xié)同試驗(yàn)篩選金屬酶結(jié)果顯示，陽性6株，毛細(xì)管PCR微流控芯片電泳檢測NDM-1陽性2株，同時進(jìn)行普通PCR檢測結(jié)果也是2株NDM-1陽性。攜帶NDM-1耐藥菌在血平板上的培養(yǎng)情況見圖5A；藥敏紙片美羅培南和亞胺培南抑菌圈直徑為6 mm≤22 mm，該耐藥菌碳青霉烯類酶陽性，見圖5B；K-B紙片結(jié)果為：EDTA復(fù)合紙片抑菌環(huán)直徑25 mm，比單藥紙片直徑6 mm增大≥5 mm，因此該耐藥菌金屬酶陽性,見圖5C。NDM-1陽性菌毛細(xì)管液滴PCR微流控芯片檢測結(jié)果見圖6；對應(yīng)的瓊脂糖電泳結(jié)果見圖7。

圖5 NDM-1陽性血平板培養(yǎng)和K-B紙片藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：a為DNA marker；b為有NDM-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物；c為無NDM-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖6 NDM-1基因檢測芯片電泳結(jié)果

注：M為DL2000 Marker；1為無NDM-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2、3為有NDM-1基因耐藥菌擴(kuò)增產(chǎn)物

圖7 NDM-1基因檢測瓊脂糖電泳結(jié)果

2.5芯片毛細(xì)管液滴PCR特異性考察 經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化，按最優(yōu)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對該陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。芯片檢測結(jié)果與測序結(jié)果在Pub Med上與FN396876.1序列進(jìn)行比對，100%符合。

2.6芯片毛細(xì)管液滴PCR檢出限考察 將已經(jīng)涂布平板中的原菌液標(biāo)本按107、106、105、104、103、102、101、100梯度稀釋，分別作為PCR模板，PCR反應(yīng)體系和循環(huán)條件同前。PCR產(chǎn)物在芯片電泳和2%瓊脂糖電泳上檢測。芯片電泳可以檢測到最低菌液濃度為1.15×101CFU/mL,相比瓊脂糖電泳最低菌液濃度1.5×103CFU/mL更靈敏。

2.7臨床標(biāo)本檢測 本試驗(yàn)采用碳青霉烯類酶陽性K-B紙片法和毛細(xì)管PCR結(jié)合微流控芯片電泳對本院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室2016-2017年收集的80株耐藥腸道桿菌(美羅培南MIC≥2 μg/mL)和60株鮑曼不動桿菌(亞胺培南MIC≥64 μg/mL)耐藥菌進(jìn)行篩查，結(jié)果顯示，K-B紙片法檢出碳青霉烯類酶陽性6株，其中金屬酶陽性2株；采用毛細(xì)管PCR結(jié)合微流控芯片電泳方法篩選出2株NDM-1基因陽性，并經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，確證攜帶NDM-1基因。

3 討 論

“超級細(xì)菌”最早發(fā)現(xiàn)于2008年，源自一名印度籍的瑞典患者體內(nèi)的一種細(xì)菌。由于多種抗生素對該細(xì)菌均無效，于是一種具有特殊性的基因被檢測出來，這個基因就是NDM-編碼基因[6]。碳青霉烯酶抗生素是革蘭陰性菌醫(yī)院內(nèi)感染最后一線治療藥物，碳青霉烯酶耐藥的產(chǎn)生將嚴(yán)重威脅到全球衛(wèi)生治療系統(tǒng)[7]。最近發(fā)現(xiàn)的NDM-1引起人類的廣泛關(guān)注，也被大眾媒體報道。盡管報道病例數(shù)非常少，影響還不是很大，但診斷實(shí)驗(yàn)室需要發(fā)展一種快速檢測的方法，以備將來醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)流行時應(yīng)用。

目前，產(chǎn)NDM-1細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷包括Etest法表型篩查試驗(yàn)、改良霍奇試驗(yàn)表型確證試驗(yàn)及自動化鑒定與藥敏試驗(yàn)等，但是都無法區(qū)分耐藥類型和耐藥基因，且需要時間長，特異度低[8]。分子診斷檢測方法彌補(bǔ)了常規(guī)方法的不足，可在1 h內(nèi)完成檢測，具有高敏感度和特異度。通常PCR前需要消耗大量時間進(jìn)行標(biāo)本DNA提取和前處理。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠的制備，而且電泳時間需要30 min以上，整個PCR操作過程不僅費(fèi)時費(fèi)力，而且還需要昂貴的儀器。

本研究采用的毛細(xì)管振蕩流PCR裝置，使用量注射泵驅(qū)動PCR液滴在不同恒定溫區(qū)往返運(yùn)動，因無需加熱模塊的升溫和降溫過程，所以大大縮短了PCR時間。并且，該系統(tǒng)使用標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管作為PCR反應(yīng)器，價格便宜，且毛細(xì)管PCR只需3 μL PCR反應(yīng)液，節(jié)約試劑，大大降低了檢測成本。本研究采用改良型Mighty Amp DNA聚合酶，直接從臨床標(biāo)本中擴(kuò)增目的片段，無需核酸提取預(yù)處理，將標(biāo)本直接進(jìn)行PCR，有望實(shí)現(xiàn)集成化核酸分析。此外，本研究用微流控芯片電泳分析PCR產(chǎn)物，分離檢測時間為300 s，相比常規(guī)瓊脂糖電泳檢測大大縮短了時間，而且本方法檢測敏感度高，細(xì)菌檢測敏感度為1.15×101CFU/mL。本研究中K-B紙片法檢出碳青霉烯類酶陽性為6株，其中金屬酶陽性2株；毛細(xì)管PCR結(jié)合微流控芯片電泳篩選出2株NDM-1基因陽性，同時進(jìn)行普通PCR檢測結(jié)果也是2株NDM-1陽性,經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，這2株確證攜帶NDM-1基因。另外4株可能含有碳青霉烯類酶的其他耐藥基因型，還需進(jìn)一步深入研究。本方法檢測結(jié)果經(jīng)過測序驗(yàn)證，完全符合，由此說明本方法對NDM-1基因檢測準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)。

總之，該方法在40 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)NDM-1耐藥菌擴(kuò)增產(chǎn)物的快速分離檢測，細(xì)菌檢測敏感度為1.15×101CFU/mL，對NDM-1基因檢測準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，具有快速、廉價等特點(diǎn)，適合超級細(xì)菌NDM-1的早期快速現(xiàn)場診斷。