隋廷林 彭兆新 馬麗娟 梁曉靜 范迎春

(山東東營勝利石油管理局勝利醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 東營 257055)

氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的神經(jīng)元細胞凋亡是腦缺血、腦缺血再灌注損傷等病理性腦損傷的病理基礎(chǔ)，因此減少氧自由基所導(dǎo)致的神經(jīng)元細胞凋亡對腦血管病的治療具有重要意義〔1〕。神經(jīng)節(jié)苷脂是哺乳動物細胞表面上的一種含有唾液酸的鞘糖脂，在神經(jīng)元的生長、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用〔2〕。以往研究報道神經(jīng)節(jié)苷脂對腦缺血再灌注大鼠海馬及腦缺血大鼠海馬組織具有顯著保護作用〔3，4〕，但具體的作用機制報道較少，本研究探討神經(jīng)節(jié)苷脂對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的保護作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠PC12細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫。主要試劑與儀器：噻唑藍(MTT)，Annexin V/PI流式雙染試劑盒，天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、9活性檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒，小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗B淋巴細胞癌(Bcl)-2，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)，核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα及p-IκBα多克隆抗體均購自美國Abcam公司；垂直電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀均購自美國伯樂公司；MK3酶標儀購自美國thermo公司；168-1000XC型酶標儀均購自美國BD公司。

1.2實驗分組及給藥 將處于生長對數(shù)期的PC12細胞隨機分為正常組，模型組，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組；其中模型組及神經(jīng)節(jié)苷脂組預(yù)先給予200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組給予12.5、25.0、50.0 μmol/L神經(jīng)節(jié)苷脂，正常組及模型組均給予等體積的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測細胞活力 將PC12細胞接種到96孔板，24 h后，按1.2分組及給藥后，每孔加入20 μl MTT孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl二甲亞砜，使沉淀物溶解并于微量振蕩器震蕩10 min，最后于酶標儀570 nm處測定OD值。

1.4Annexin V-PI流式雙染檢測細胞活力 將PC12細胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h，每組收集1×105個細胞/ml，并分別加入細胞結(jié)合緩沖液及PI染色液，在室溫孵育10 min后，1 h內(nèi)進行流式檢測，分析細胞凋亡情況。

1.5細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)含量測定 將PC12細胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入20 μmol/L雙氫乙酰乙酸-二氨熒光黃(DCFH-DA)的PBS，37℃孵育2 h，后熒光顯微鏡下進行檢測。

1.6比色法檢測細胞中Caspase3、9活性 將PC12細胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h后，收集細胞并裂解，收獲上清液后按照Caspase3、9試劑盒說明書檢測其活性，酶標儀測定OD 405 nm值，即Caspase3活性。

1.7Western印跡檢測細胞中Bax，Bcl-2，p-NF-κB p65及p-IκBα蛋白表達 將PC12細胞接種到6孔板，24 h，按1.2分組、給藥并培養(yǎng)48 h后，在冰浴條件下刮下細胞并裂解，獲得細胞上清液即是總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，蛋白變性。制作濃縮膠和分離膠，蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα及p-IκBα多隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度皆為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1 h。最后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)節(jié)苷脂對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞活力、ROS強度及細胞凋亡的影響 與正常組比較，模型組細胞活力顯著降低，ROS熒光強度明顯提高，早期及晚期細胞凋亡率顯著提高(均P<0.01)；與模型組比較，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組細胞活力顯著提高，熒光強度顯著降低，早期及晚期細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組PC12細胞活力、細胞凋亡及ROS含量的比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01,下表同

2.2神經(jīng)節(jié)苷脂對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Caspase3、9活性的影響 與正常組比較，模型組Caspase3、9活性顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組PC12細胞中Caspase3、9活性的比較

2.3神經(jīng)節(jié)苷脂對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞中Bax、Bcl-2及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組Bcl-2、Bax、p-NF-κB，p65及p-IκB2表達顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，神經(jīng)節(jié)苷脂低中、高濃度組Bcl-2表達顯著上調(diào)(P<0.01)，神經(jīng)節(jié)苷脂低、中、高濃度組中Bax、p-NF-κB P65及p-IκB2表達顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖1，圖2，表3。

圖1 各組PC12細胞中Bax及Bcl-2表達

圖2 各組PC12細胞中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達

組別Bcl-2/GAPDHBax/GAPDHp-IκBα/IκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65正常組0.95±0.110.16±0.010.12±0.010.08±0.01模型組0.18±0.021)1.28±0.121)1.98±0.201)0.94±0.091)低濃度組0.19±0.020.53±0.052)0.87±0.092)0.68±0.062)中濃度組0.45±0.042)0.55±0.052)0.43±0.042)0.20±0.022)高濃度組0.66±0.062)0.25±0.022)0.28±0.022)0.09±0.092)

3 討 論

腦缺血、腦缺血再灌注等病理過程可產(chǎn)生大量氧自由基，引起腦神經(jīng)元細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細胞膜過氧化，DNA斷裂，線粒體損傷，使病情加重并惡性循環(huán)〔1〕。H2O2是典型的氧自由基產(chǎn)物之一，PC12細胞與神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能類似，因此H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型常被用來研究神經(jīng)細胞凋亡的體外模型〔5〕。神經(jīng)節(jié)苷脂是位于哺乳動物細胞膜表面上的一種含有唾液酸的糖鞘脂，是細胞膜的一部分，廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠接收并對細胞膜內(nèi)外信息發(fā)生反應(yīng)，進而改變細胞膜結(jié)構(gòu)，影響細胞對外界刺激的反應(yīng)〔2〕。研究顯示外源性神經(jīng)節(jié)苷脂能夠通過血腦屏障，對腦損傷區(qū)域的神經(jīng)組織進行修復(fù)〔6〕。杜江等〔3〕研究表明神經(jīng)節(jié)苷脂能通過上調(diào)(CREB)表達進而保護腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷。高利潔等〔4〕表明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著減少腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡，進而改善腦損傷。同時體外研究顯示神經(jīng)節(jié)苷脂對6-羥基多巴胺、脂多糖誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡具有顯著抑制作用〔7〕。

本研究結(jié)果表明12.5、25.0、50.0 μmol/L神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著提高細胞活力，且此劑量范圍與以往研究報道較為一致〔7〕。另外，本研究結(jié)果表明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著降低細胞凋亡率，與神經(jīng)節(jié)苷脂抑制6-羥基多巴胺、脂多糖誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡作用一致〔7〕。說明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡，且神經(jīng)節(jié)苷脂能降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中氧自由基水平。

細胞凋亡受細胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl-2 家族最為常見。Bcl-2能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號傳遞，促進細胞存活。而Bax還能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，使Caspase家族產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase家族接收到上游凋亡信號后，起始Caspase9將信號逐級傳遞并最終傳遞給Caspase3，使細胞膜破裂，DNA斷裂，最終引起細胞凋亡。細胞的凋亡也受多種信號通路調(diào)控，NF-κB是其中一種。NF-κB是一類廣泛存在于哺乳動物中的含有IκB增強位點的NF，在生理條件下，NF-κB亞基p65與IκB形成復(fù)合物靜置于細胞質(zhì)中，在受到紫外線，化學(xué)試劑等外界刺激后，復(fù)合物解離，IκB被降解并磷酸化，p65進入細胞核，調(diào)控Bcl-2、Caspase3等基因的轉(zhuǎn)錄〔8〕。研究表明H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Caspase3、9活性提高，Bax表達量上調(diào)，Bcl-2表達量下調(diào)，同時NF-κB信號通路被激活〔9～11〕，因此當(dāng)阻斷此過程能一定程度上抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。本研究結(jié)果表明神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著降低Caspase3、9活性，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax、p-NF-κB p65及p-IκBα表達，最終抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

綜上，神經(jīng)節(jié)苷脂能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡，與降低Caspase3、9活性，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax表達有關(guān)，此過程是通過抑制NF-κB信號通路實現(xiàn)的。