黃 鋒 賈巖龍 邵煥霞 詹合琴 孫 娟 劉會茹 牛 倩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肺纖維化(PF)是由多種原因引起的彌漫性肺部疾病的最終結(jié)果，該病的主要特征是成纖維細(xì)胞的過度增殖與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積〔1，2〕。PF臨床癥狀主要是缺氧、進(jìn)行性的呼吸困難、干咳、酸中毒和呼吸衰竭〔3〕。該病確診后平均可存活為2～5年，一般年齡越大發(fā)病率越高，發(fā)病原因可能與遺傳、環(huán)境污染、藥物(如百草枯)、免疫力異常、二氧化硅等因素相關(guān)〔4,5〕。盡管PF的發(fā)病機(jī)制不明，但目前比較認(rèn)同的一個基本機(jī)制為：各種不良因素刺激引起肺部損傷或炎癥，導(dǎo)致肺泡與肺間質(zhì)中巨噬細(xì)胞等其他炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)增多，進(jìn)而促使成纖維細(xì)胞分裂、增殖為肌成纖維細(xì)胞，致使ECM異常沉積，最終形成PF〔6,7〕。胰島素樣生長因子(IGF)-1作為一個旁分泌成纖維細(xì)胞的激活劑在成纖維細(xì)胞的激活和PF發(fā)生中起著重要的作用〔8，9〕。信號傳導(dǎo)蛋白(Smad)3也是PF的重要介導(dǎo)者，其在PF的發(fā)生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起重要調(diào)節(jié)作用〔10，11〕。三七皂苷Rg1是從云南中藥材三七根莖中提取的單體化合物，為三七總皂苷的主要成分之一〔12〕。三七總皂苷在動物模型中具有顯著的抗PF作用〔13〕，但其單體成分三七皂苷Rg1對PF保護(hù)作用及其對PF組織中Smad3和IGF-1基因表達(dá)的影響尚不清楚。本研究探討博來霉素誘導(dǎo)的PF大鼠采用三七皂苷Rg1治療后Smad3和 IGF-1 mRNA 表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑和儀器 三七皂苷Rg1由四川成都瑞芬思生物科技有限公司提供，為白色粉末，純度>98%；博來霉素由日本化藥株式會社提供(15 mg/支，產(chǎn)品批號：460430)；羥脯氨酸(Hyp)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；All-in-OneTMFirst strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、HiScript TM QRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 購自南京Vazyme 科技公司；Smad3 (GeneCopoeia?,USA,ID:MQP030343)，IGF-1 (GeneCopoeia?,USA,ID:MQP026708)和內(nèi)參GAPDH(GeneCopoeia?,USA,ID:MQP027158)購于鄭州樂睿生物科技有限公司；瓊脂糖(批號111760)購于西班牙Biowest公司。其他常規(guī)試劑如異丙醇、氯仿和焦碳酸二乙酯(DEPC)等購于上海化學(xué)試劑公司。ABI StepOne實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀，美國ABI公司；Nanodrop-2000紫外/可見光分光光度計，美國賽默飛世爾公司；AE240精密分析天平瑞士Mettler公司;MulTISKAN酶標(biāo)儀,美國Thermo公司；16K-R低溫臺式離心機(jī)，長沙鑫奧儀器儀表有限公司；Hfsafe-1200 生物安全柜，西化儀北京科技有限公司；MDF-U4086S超低溫冰箱，日本SANYO公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2PF模型的制備 清潔級SD成年雄性大鼠，購于鄭州大學(xué)動物實驗中心(許可證號：SCXK Henan 2010-0001，合格證號：No.0005496)。本項目對動物的處理遵照新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物管理委員會和中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。用單一劑量5 mg/kg的博來霉素氣管內(nèi)注射誘導(dǎo)PF模型〔14,15〕。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)使其麻醉，然后仰臥固定于大鼠解剖臺上。大鼠頸部正中皮膚切口2～3 cm,將博來霉素快速注入氣管，然后使動物直立并旋轉(zhuǎn)幾次，以保證藥物能均勻地分散到肺組織。手術(shù)區(qū)域再次消毒后分層縫合，動物被放回籠中密切觀察。假手術(shù)組經(jīng)歷同樣的手術(shù)過程，但氣管內(nèi)滴入生理鹽水代替博來霉素。

1.3動物分組和給藥 138只清潔級健康雄性SD大鼠，體重(240±10)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、模型+陽性對照(M+P)組、模型+三七皂苷Rg1低劑量(18 mg/kg)(M+RL)組、模型+中劑量(36 mg/kg)(M+RM)組和模型+高劑量(72 mg/kg)(M+RH)組，共6組，假手術(shù)組動物18只，其他各組每組24只。假手術(shù)組無死亡，其他各組剔除死亡動物后，模型組14只，陽性對照組、M+RL和M+RM組各18只，M+RH組20只。此實驗在動物造模后當(dāng)天開始給藥，每天1次，均采用灌胃給藥。假手術(shù)組和模型組給予同等體積的生理鹽水(5 ml/kg)，M+P組給予醋酸潑尼松(5 mg/kg)，三七皂苷Rg1各劑量組給予相應(yīng)劑量的三七皂苷Rg1。至連續(xù)用藥7 d時，處死每一組中的一半動物，剩余的各組動物接著用藥至28 d后再處死。每一組中6只動物的肺組織用于qPCR測定，其余動物的肺組織用于測定PF評分和Hyp的含量。

1.4Masson染色和PF評分 大鼠右中肺葉制成5 μm厚石蠟切片。組織切片用Masson三色藍(lán)染色方法進(jìn)行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟后用蘇木素染色6 min，Masson復(fù)合染色液5 min，5%磷鎢酸5 min和2%苯胺藍(lán)液5 min，染色完畢后用高清晰圖像分析儀攝像觀察。照片中藍(lán)色越多表明PF程度越重，根據(jù)肺組織Masson染色情況并參照PF評分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行評分。PF分級：0級：無PF(-)；1級：輕度PF(+)，病變范圍局限在全肺20%以下；2級：中度PF()，病變范圍占全肺20%～50%；3級：重度PF()，病變范圍大于50%，肺泡融合，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。-為0分，+為1分，為2分，為3分，將等級資料轉(zhuǎn)化為計量資料。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測肺組織中Hyp的含量 各組均取右下葉肺組織0.2 g加1.8 ml的冰鹽水,離心10 min (-4℃，1 000 r/min),取上清液保存在4℃，考馬斯亮藍(lán)對各樣品進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度和吸光度值求出Hyp的回歸方程和相關(guān)系數(shù)為Y=0.002 2X-0.106 8，R2=0.949。每個樣本Hyp的有色試樣吸光度值(OD值)用MulTISKAN酶標(biāo)儀(Mk3,Thermo,USA)在450 nm波長處測定，然后將樣品的OD值代入方程式計算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即可得出每一樣品所含的Hyp含量，每個樣品的OD值越大，其蛋白含量越高。

1.6qPCR技術(shù)檢測Smad3和IGF-1 mRNA的表達(dá) 處死大鼠后，取100 mg的左肺組織在液氮中磨碎。Trizol試劑提取樣本中的總RNA，用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取各樣本中1 μl的cDNA用AceQTM qPCR SYBR? Green Master Mix試劑盒執(zhí)行qRT-PCR過程。PCR反應(yīng)采用連續(xù)檢測系統(tǒng)執(zhí)行。熱循環(huán)和SYBR綠色熒光被用于qRT-PCR的定量檢測。PCR條件為：95℃ 10 min;95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 15 s,40個循環(huán)。溶解曲線分析被用于執(zhí)行終止PCR循環(huán)后對非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體的評估。在初始優(yōu)化運行期間,4倍系列的稀釋用于顯示每個基因的線性放大范圍。閾值循環(huán)(Ct)代表PCR循環(huán)中一個綠色SYBR熒光的增加高于基線信號可以被首先檢測到。根據(jù)每組每個樣本的Ct值相對定量得出ΔCt，ΔCt對應(yīng)于目的基因Ct和參考基因Ct之間的差異。最后按F=2-ΔΔCt 計算方法取每組的2-ΔΔCt值檢測目的基因與對照基因表達(dá)的差異。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊者采用 LSD 方法，方差不齊者采用DunnettT3方法，組內(nèi)時間點的比較采取t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1三七皂苷Rg1對PF大鼠PF評分的影響 模型組PF評分(3.29分)較高，與假手術(shù)組(0.28分)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；三七皂苷Rg1各劑量組均可降低PF評分(M+RL組1.57分、M+RM組1.43分、M+RH組1.15分)，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其低、中、高劑量之間存在劑量依賴性；與M+P組(2.00分)比較，M+RH組作用較好(P<0.05)。見圖1。

2.2三七皂苷Rg1對PF大鼠肺組織Hyp含量的影響 給藥28 d后，模型組Hyp含量(2.29±0.32)與假手術(shù)組(1.61±0.08)比較顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，M+RL、M+RM、M+RH組呈劑量依賴性地降低Hyp的含量(1.89±0.05、1.66±0.08、1.04±0.18，P<0.05、P<0.01)。M+RM、M+RH組Hyp含量與M+P組(1.92±0.32)相比明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組PF評分比較(Masson染色，×200)

2.3三七皂苷Rg1對PF大鼠Smad3 mRNA表達(dá)的影響 給藥7 d和28 d后，模型組肺組織Smad3 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)；M+P組、M+RL、M+RM、M+RH組可明顯降低Smad3 mRNA表達(dá)，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；M+RL、M+RM、M+RH組與M+P組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.4三七皂苷Rg1對PF大鼠IGF-1 mRNA表達(dá)的影響 給藥7 d和28 d后模型組肺組織IGF-1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，M+RL、M+RM、M+RH、M+P組不同時間點呈劑量依賴性地降低IGF-1 mRNA表達(dá)(P<0.05 或P<0.01)；與M+P組比較，M+RH組作用較好(P<0.05)，見表1。

表1 各組給藥7、28 d后肺組織Smad3、IGF-1 mRNA表達(dá)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01;與M+P組比較：4)P<0.05

3 討 論

PF為近年來呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重的疾病之一，起病隱匿且病死率高。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療方法有限。因此，在建立穩(wěn)定合理的PF模型的基礎(chǔ)上研究具有保護(hù)作用的藥物及其作用機(jī)制十分必要。 國內(nèi)外文獻(xiàn)報告中關(guān)于制作PF模型的方法有很多種，如用博來霉素、百草枯、放射線及高濃度氧等，其中博來霉素氣管內(nèi)給藥因存在方法可靠、操作簡單、周期短等〔16〕優(yōu)點，且博來霉素誘導(dǎo)的動物PF模型與人PF的病理學(xué)改變極其相似，所以用博來霉素誘導(dǎo)PF模型是目前公認(rèn)的經(jīng)典造模方法〔17〕。

目前認(rèn)為PF的特點是經(jīng)早期的肺損傷-肺泡炎到PF這樣的一個過程〔15，18〕。本實驗結(jié)果提示博來霉素誘導(dǎo)PF的典型特征與他人的研究一致〔19〕。Hyp是膠原形成的特征性生物標(biāo)記之一，在ECM沉積和重構(gòu)中起重要作用〔20〕。三七皂苷Rg1對PF的病程有減輕和保護(hù)作用。

IPF的發(fā)生機(jī)制通常被認(rèn)為與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路的過度激活有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，如果抑制TGF-β依賴性Smads蛋白家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Smad3的表達(dá)，可以預(yù)防PF的形成〔21，22〕。IGF-1是TGF-β介導(dǎo)的眾多信號傳導(dǎo)途徑中對于纖維化過程起重要作用的輔助因子。以往研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化病人肺泡灌洗液的水平較正常人高〔23〕，在博來霉素誘導(dǎo)的PF動物模型的肺泡灌洗液細(xì)胞中IGF-1 mRNA表達(dá)水平較對照組增強〔24〕。本研究結(jié)果提示三七皂苷Rg1對PF的保護(hù)作用與其降低Smad3 和IGF-1 mRNA的表達(dá)有關(guān)。