陸常輝，桂王艷

（1.瀚暉制藥有限公司，浙江 杭州 310020；2.浙江海正藥業(yè)股份有限公司藥品研發(fā)QC，浙江 杭州 311404）

博來霉素為發(fā)酵來源的糖肽類抗腫瘤抗生素類藥物，適用于皮膚癌、頭頸部癌（上頜竇癌、咽部癌、唇癌等）、肺癌（特別是原發(fā)和轉(zhuǎn)移性磷癌）、食道癌等的治療[1]。博來霉素為多組分藥物，因此組分是藥品質(zhì)量控制中重要的項目之一。本文參考相關(guān)文獻，建立了比各藥典標(biāo)準(zhǔn)更優(yōu)的博來霉素組分檢查方法。方法經(jīng)驗證，專屬性、線性、精密度和準(zhǔn)確度等均符合要求，可保證組分檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD高效液相色譜儀，軟件LabSolutions色譜工作站；安捷倫1269高效液相色譜儀，軟件OpenLab色譜工作站；S220型pH計（METTLER TOLEDO公司），XP26型電子分析天平（METTLER TOLEDO公司）。

注射用鹽酸博來霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號20BH03010、20BH03011、20BH03012）；甲醇和乙腈均為色譜純，己烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑，乙二胺四乙酸二鈉和氨水為分析純，水為純化水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6mm×150mm，3.5μm）；以己烷磺酸鈉溶液（取己烷磺酸鈉4.7g與乙二胺四醋酸二鈉1.86g，加0.08mol/L醋酸溶液使溶解并稀釋至1000ml，用氨溶液調(diào)節(jié)pH值至4.3）為流動相A；甲醇:乙腈（70:30）為流動相B；按表1線性梯度洗脫；柱溫為35℃；流速為每分鐘1.0ml；檢測波長為254nm；進樣量10μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 系統(tǒng)適用性

取本品適量，加水制成每1ml約含2500博來霉素單位的溶液，量取10μl注入液相色譜儀，按表1進行梯度洗脫。色譜圖中兩個主組分峰與各自相鄰雜質(zhì)峰的分離度不小于1.0；理論塔板數(shù)按博來霉素A2峰計算，應(yīng)不低于8000。

2.3 組分測定

取本品，加水制成每1ml約含2500博來霉素單位的溶液，搖勻，精密量取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按峰面積歸一化法計算博來霉素A2，博來霉素B2，博來霉素B4，去甲基博來霉素A2，去甲基博來霉素A2外其他雜質(zhì)之和。

3 方法學(xué)研究

3.1 專屬性考察

分別在1.10W/m2強光，0.5N鹽酸溶液，0.01N氫氧化鈉溶液，5%過氧化氫溶液，以及在40℃、75%RH條件下對樣品進行降解。進樣測試。

降解幅度最大的熱降解條件下樣品色譜圖見圖1，在擬定的色譜條件下，博來霉素的各組分及雜質(zhì)均能有效分離，方法專屬性良好。

圖1 熱降解樣品溶液典型圖譜

3.2 檢測限和定量限

此色譜條件下，博來霉素的檢測限為0.222 μg/ml，定量限為0.739 μg/ml；去甲基博來霉素A2的檢測限為0.242 μg/ml，定量限為0.805 μg/ml；博來霉素B4的檢測限為0.227 μg/ml，定量限為0.757 μg/ml。

3.3 線性

配制線性梯度溶液，進樣檢測，博來霉素A2+博來霉素B2在定量限至2mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性，線性方程為y=4.9444x-2.7221（R2=1.0000）；去甲基博來霉素A2在0.8 μg/ml～128 μg/ml內(nèi)呈良好線性，線性方程為y=4.5821x-0.8333（R2=1.0000）；博來霉素B4在0.75 μg/ml～30 μg/ml呈良好線性，線性方程為y=3.2560x-0.1221（R2=1.0000）。

3.4 準(zhǔn)確度

將已知量的組分加入博來霉素中，再按面積歸一化法測定各自的量并計算回收率。結(jié)果表明在8.051μg/ml～120.770μg/ml的加樣范圍內(nèi)，去甲基博來霉素A2的回收率范圍為92.5%～96.1%；在0.750μg/ml～30.019μg/ml的加樣范圍內(nèi)，去博來霉素B4的回收率范圍為96.4%～103.4%；在8.051μg/ml～120.770μg/ml的加樣范圍內(nèi)，去甲基博來霉素A2的回收率范圍為92.5%～96.1%；

3.5 精密度

重復(fù)性：配制6份加入雜質(zhì)的供試品溶液，測定組分及雜質(zhì)。結(jié)果顯示6份樣品溶液中博來霉素A2、博來霉素B2和博來霉素A2+博來霉素B2的RSD小于0.1%，其他總雜質(zhì)的RSD小于3.2%，重復(fù)性符合要求；

中間精密度：在不同HPLC系統(tǒng)、不同批次的色譜柱，不同實驗人員及不同日期檢測重復(fù)性同批次樣品。并將結(jié)果于與重復(fù)性實驗對比，博來霉素A2、博來霉素B2及兩者的加和的差值在0.1%～0.2%之間。去甲基博來霉素A2、博來霉素B4，及除以上雜質(zhì)外的其他雜質(zhì)的和的差值不超過0.06%。證明方法具有良好的中間精密度。

4 組分測定結(jié)果

采用以上方法測定海正藥業(yè)的三批注射用鹽酸博來霉素，博來霉素A2與博來霉素B2的和分別為95%、96%、95%；博來霉素B4均小于1%；去甲基博來霉素A2分別為1.0%、0.9%和1.2%；去甲基博來霉素A2外其他雜質(zhì)之和分別為3.6%、3.4%、3.7%。

5 討 論

對比本方法與現(xiàn)行版美國藥典[2]、英國藥典[3]和日本藥典[4]收載的博來霉素相關(guān)組分方法，本方法能檢測出更多的雜質(zhì)，有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。對比結(jié)果詳見表2。

表2 不同方法組分檢測結(jié)果對比