齊汝霞 張 鵬 楊欣欣 王鳳琴 程葆華

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

Aplein-13主要分布于心臟、大腦、下丘腦中〔1〕，研究表明其是正常人體血漿中最主要的Apelin亞型，血漿濃度為7.7～23.3 μg/L。并且其具有多種不同的生物功能和作用，參與心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等生理病理過(guò)程調(diào)節(jié)〔2〕。血管性癡呆(VD)是僅次于阿爾茨海默病(AD)后的第二大癡呆性疾病，也是迄今為止唯一可以治療的癡呆類(lèi)型〔3〕。本實(shí)驗(yàn)觀察Apelin-13對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1儀器 電子天平(上海電子天平技術(shù)有限公司)；烤箱(型號(hào)YHG-30×35 ，深圳倍耐爾特科技有限公司)；跳臺(tái)儀(上海醫(yī)聯(lián)醫(yī)學(xué)儀器發(fā)展有限公司)；電子秤(上海先悅機(jī)電有限公司)。

1.2試劑 亞硝基鐵氰化鈉(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所 注冊(cè)號(hào)：CNAB035-Q)；普魯卡因(上海羽朵生物 產(chǎn)品編號(hào)：ML5227)；Apelin-13(Sigma 貨品編號(hào)：A6469)；尼氏染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司 貨品編號(hào)：DK0022-3*100)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色液(美國(guó)索來(lái)寶公司 貨品編號(hào)：T8170)；磷酸二氫鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠 級(jí)別:分析純 CAS編號(hào):13472-35-0)；多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司 級(jí)別:分析純 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào):津Q/HG3076-99)；磷酸氫二鈉(天津市鼎盛鑫化工有限公司 CAS編號(hào):10039-32-4 級(jí)別:分析純)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H37022336)；水合氯醛(中國(guó)白鶴化工廠，批號(hào)：850208)。

1.3VD大鼠模型制備 選用清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠，體重180～250 g，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。大鼠在手術(shù)前24 h禁食，不禁水，10%水合氯醛3.5 ml/kg給大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后將其固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上，頸部消毒后行正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，腹腔注射降壓藥亞硝基鐵氰化鈉1.25 mg/kg降低腦血流量 ，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15 min，再通10 min，共2次，完成后縫合傷口、保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈不夾閉〔4〕。按Longa等〔5〕的五級(jí)評(píng)分法，符合以下5個(gè)條件之一均可鑒定模型成功：大鼠一側(cè)前肢不能充分伸展；向一側(cè)做環(huán)形運(yùn)動(dòng)；向一側(cè)傾倒；局部神經(jīng)灶中度喪失；不能自然行走。

1.4動(dòng)物分組及給藥 造模成功后將其隨機(jī)分為模型組、Apelin-13 50 μg/kg組、Apelin-13 100 μg/kg組，假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈不夾閉。給藥組側(cè)腦室注射Apelin-13 5 μl，模型組和假手術(shù)組分別注射等量蒸餾水。側(cè)腦室注射方法：將麻醉大鼠固定在側(cè)腦室定位儀上，剪開(kāi)大鼠的頭皮，找到頭骨的前囟并以前囟為原點(diǎn)，右移1.6 mm，前移0.8 mm，用筆在此處標(biāo)記，用大針頭鉆孔，把微量注射器針尖調(diào)至剛剛接觸頭骨處，然后針頭向下進(jìn)2.8 mm，給予5 μl藥物，3 min內(nèi)注射完，針頭在顱內(nèi)停留1 min，然后縫合。

1.5TTC染色觀察對(duì)腦組織缺血的影響 將大鼠用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后直接取腦，在-18℃冰箱中冷凍20 min左右后，將鼠腦置入專(zhuān)用的腦槽，將大腦切為厚度2 mm的連續(xù)切片6片，依次放入十二孔板中，然后注入2%的TTC染色液，避光，放入37℃恒溫箱25 min，均勻染色后，用無(wú)菌注射器抽出染色液，再用4%多聚甲醛固定24 h，正常大腦組織染成鮮紅色，缺血組織呈蒼白色，將染色完成的大腦組織依據(jù)切片先后依次排列，用數(shù)碼相機(jī)拍照〔6〕。

1.6跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 術(shù)后1 w進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練期和實(shí)驗(yàn)期。訓(xùn)練時(shí)把大鼠放到跳臺(tái)內(nèi)讓其熟悉環(huán)境3 min，然后接通電源5 min，大鼠感受到電擊后，其一般的反應(yīng)是跳上平臺(tái)來(lái)逃脫電擊。訓(xùn)練時(shí)如果有大鼠始終沒(méi)有跳上平臺(tái)則棄去不用。訓(xùn)練結(jié)束后第2天，再一次將大鼠放入跳臺(tái)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先讓大鼠適應(yīng)3 min，再通電5 min，記錄大鼠第一次跳上平臺(tái)的時(shí)間，即跳臺(tái)潛伏期(SDL)，觀察大鼠在5 min內(nèi)跳下平臺(tái)的次數(shù)，即錯(cuò)誤次數(shù)(ET),若觀察期內(nèi)大鼠未跳下平臺(tái)，ET計(jì)為0，SDL計(jì)為觀察時(shí)間為5 min〔5〕。

1.7利用尼氏染色觀察對(duì)大鼠神經(jīng)元的影響 術(shù)后1 w，大鼠麻醉后，將其仰臥位固定于鼠板上，剪開(kāi)胸腔，將針頭從心尖刺入左心室用4%多聚甲醛200～250 ml進(jìn)行灌注(總灌注時(shí)間控制在30 min內(nèi))，至大鼠身體僵直，肝臟變硬，將頭部取下迅速取腦，持刀片將大鼠的大腦與小腦分開(kāi)，留大腦部位平分為三份，取中間一份，置于裝有多聚甲醛液體中固定。24 h后將固定好的大腦切片拿出進(jìn)行修整、水浸-脫水、透明-浸蠟與包埋-切片、裱片、烤片-脫蠟、復(fù)水-染色-脫水、透明-封固。將切片置于100倍顯微鏡下，觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神細(xì)胞尼氏小體染色情況〔7〕。

1.8統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析及SLD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TTC染色對(duì)腦組織缺血的影響 假手術(shù)組大鼠腦切片呈鮮紅色，模型組大鼠觀察到大面積蒼白色梗死灶。與模型組比較，Apelin-13 50 μg/kg組的缺血區(qū)縮小，Apelin-13 100 μg/kg組的缺血區(qū)基本消失。見(jiàn)圖1。

圖1 TTC染色后各組大鼠腦切片缺血區(qū)比較

2.2利用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

2.2.1對(duì)大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)SDL的影響 與假手術(shù)組〔(287.7±108.8)s〕比較，模型組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)SDL〔(48.6±4.7)s〕顯著縮短(P<0.01)。與模型組相比，Apelin-13 50 μg/kg組〔(184.0±125.67)s〕和Apelin-13 100 μg/kg組〔(192.7±146.1)s〕的SDL顯著延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)。

2.2.2對(duì)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)ET的影響 與假手術(shù)組〔(0.4±1.1)次〕比較，模型組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的ET〔(3.6±2.4)次〕顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，Apelin-13 100 μg/kg組〔(0.8±0.7)次〕大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)ET明顯減少(P<0.05)。Apelin-13 50μg/kg組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)ET〔(2.2±1.8)次〕無(wú)明顯變化(P>0.05)

2.3利用尼氏染色觀察對(duì)大鼠神經(jīng)元的影響 假手術(shù)組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核多為圓形或橢圓形且呈淡紫色，核仁清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的尼氏顆粒豐富。模型組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞多呈空泡狀，神經(jīng)元核仁固縮或消失，尼氏顆粒不明顯。

與模型組相比，Apelin-13 50 μg/kg組CA1、CA3區(qū) 神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)趨于完整，核仁分明;Apelin-13 100 μg/kg組神經(jīng)元數(shù)明顯增多，細(xì)胞排列緊密，形態(tài)正常，尼氏體多且清晰。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較(×40)

圖3 各組VD大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較(×40)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注并配以注射亞硝基鐵氰化鈉的方法，制備VD模型，造成大鼠進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶損傷和認(rèn)知功能障礙，能夠較好的模擬人的VD狀態(tài),用于藥理學(xué)研究。TTC和大鼠腦組織里的琥珀酸脫氫酶產(chǎn)生反應(yīng)，生成紅色的不溶物質(zhì)，然而在缺血的大腦組織中脫氫酶的反應(yīng)性降低，不能發(fā)生染色反應(yīng)的而表現(xiàn)為白色，所以可以區(qū)分正常的腦組織和缺血的腦組織〔8,9〕。海馬可被分為CA1、CA2、CA3、CA4四個(gè)區(qū)〔10〕。目前研究表明，這4個(gè)區(qū)域都和學(xué)習(xí)記憶尤其空間認(rèn)知功能有關(guān)。尼氏體是神經(jīng)細(xì)胞中的嗜堿性的細(xì)粒或者小體，是一種含鐵質(zhì)的核酸蛋白，在正常情況下都有其固定的形態(tài)，標(biāo)志著神經(jīng)細(xì)胞的存在，可以被堿性染料如焦油紫染成紫藍(lán)色。當(dāng)其受到損傷時(shí)，尼氏體變得模糊不清甚至消失，所以尼氏體能表現(xiàn)神經(jīng)元的功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)表明Apelin-13在一定程度上可以減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)作用。根據(jù)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)推測(cè) Apelin-13能提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。綜上，Apelin-13側(cè)腦室注射后，VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能得以改善，其機(jī)制可能與緩解腦組織缺血、減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。