陳昕　魏珍玉　岳丹丹　潘杰　鐘萍　吳丹紅

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NAD+對tMCAO小鼠的腦保護作用

陳昕魏珍玉岳丹丹潘杰鐘萍吳丹紅

目的探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)對大腦中動脈短暫阻塞再灌注(tMCAO)小鼠的腦保護作用。方法實驗分為正常組、假手術組，缺血2 h再灌注模型組和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸組；采用線栓法制作tMCAO小鼠模型；2 h后再灌注時立即腹腔注射NAD+建立tMCAO+ NAD+組；48 h后觀察以上4組小鼠行為學的差異，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法對小鼠腦組織進行染色，觀察其病理變化及計算梗死體積，利用尼氏染色法檢測尼氏小體的變化。結果與正常組及假手術組相比較，tMCAO組出現明顯神經損傷性異常行為；tMCAO組腦組織出現嚴重病理變化，腦梗死體積增大，單位體積腦組織內神經細胞數量減少，尼氏小體減少。tMCAO+NAD+組與tMCAO組比較，神經功能缺損程度明顯減輕(P<0.05)，梗死體積減小(P<0.01)，單位體積腦組織內神經細胞數量多，尼氏小體多。結論NAD+對tMCAO小鼠的腦損傷有一定的保護作用。

缺血再灌注損傷NAD+保護

當急性缺血性腦卒中發(fā)生后腦組織出現氧化應激、炎癥反應、內皮功能受損、血腦屏障破壞、纖溶系統(tǒng)失平衡、細胞死亡等多種病理生理變化[1-2]，在細胞的代謝反應中發(fā)揮重要作用的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)是脫氫酶的輔酶，其分子式為C21H27N7O14P2，是一種質子傳遞輔酶，在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)及呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用，同時NAD+作為經典的能量代謝調控分子在維持線粒體功能、能量代謝、鈣鹽平衡、基因表達等生物學功能中發(fā)揮重要作用[3-6]。

由于缺血性腦卒中有效治療方法的匱乏，探索缺血性腦損傷新的治療方法及藥物一直是腦卒中研究的焦點。近年研究發(fā)現NAD+可能是擁有多個靶點的神經保護劑[7]。國外學者發(fā)現在暫時性局部腦缺血的大鼠模型中給予NAD+能有效減少水腫形成，提示NAD+對缺血性腦損傷有保護作用[8]。目前國內尚無NAD+與缺血性腦損傷的相關研究，本研究將應用小鼠大腦中動脈短暫阻塞再灌注(temporary middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型進一步證實在急性缺血性腦卒中發(fā)生早期給予NAD+是否具有腦保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物

成年健康雄性ICR小鼠32只，體重約(25～30 g)，由斯萊克(SLAC)實驗動物中心提供。分籠以標準鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要試劑及試劑盒：

1.2.1NAD+試劑由西格瑪公司(Sigma Chemical Co)提供。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏染色試劑盒由碧云天生物技術研究所提供。

1.2.3其他試劑均為市售分析純產品。

1.3ICR小鼠中動脈阻塞是再灌注模型制作

1.3.1分組：將小鼠隨機分為4組：正常組(control 組),假手術組( sham組)，缺血2 h再灌注模型組(tMCAO 組)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸組(tMCAO+NAD+組)。

1.3.2建模：采用線栓法制作小鼠大腦中動脈短暫阻塞(temporary middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型。每組各8只；首先將老鼠仰臥位固定在手術臺上，然后腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)來實現麻醉；然后在手術顯微鏡下游離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)；用6-0線栓穿入頸外動脈殘端，結扎分叉處縫線后剪斷血管，進入頸內動脈(ICA)顱內段，阻斷大腦中動脈(MCA)起始段，線頭位于大腦前動脈；用激光多普勒血流儀測量并記錄雙側大腦中動脈血流(位置大約在前囟旁3 mm左右處)，以降低至基礎血供10%以下為建模成功的標準。120 min后將線栓抽回至頸外動脈，以恢復頸內-大腦中動脈的血供，實現再灌注。

1.3.3給藥：將NAD+溶解于0.9%的生理鹽水中，其中tMCAO+NAD+組在再灌注后立即腹腔注射NAD+生理鹽水溶液，給藥劑量為50 mg/kg。tMCAO組同時注射同容積生理鹽水。

1.3.4行為學評分：tMCAO模型建立后飼養(yǎng)48 h，采用神經損傷行為學評分(LONGA分級法)對4組小鼠術后行為進行評分[9]。具體評分準則如下：0分為無缺陷；1級為不能伸展對側前肢；2分為對側前肢屈曲；3分為輕度向對側轉圈；4分為嚴重向對側轉圈；5分為向對側跌倒。

1.3.5組織取材及大腦梗死體積計算：四組小鼠在tMCAO模型建立后飼養(yǎng)48 h進行行為學評分后，通過注射水合氯醛處死，取出大腦，冰凍切片，H-E染色觀察腦組織損傷。具體步驟如下：先用多聚甲醛固定，然后用蘇木素染色液染色，之后用自來水沖洗染液，95%乙醇洗滌，伊紅染色液染色，再經過梯度酒精脫水和二甲苯透化，行封片處理，晾干之后，再放于顯微鏡下進行觀察。利用掃描儀拍下切片的H-E全局圖片，無著色或者著色淺為梗死區(qū)。利用Image Pro Plus計算每個切片梗死對側半腦面積和梗死區(qū)未梗死區(qū)面積，差值即為梗死面積，得出每片腦組織的梗死面積、梗死側腦片的總面積、梗例對側腦片的總面積，計算梗死體積：總梗死體積=總梗死面積×腦片厚度，并計算單位體積腦組織內神經細胞數量。

1.3.6尼氏染色：用多聚甲醛固定冰凍切片，采用尼氏染色液染色，再用蒸餾水洗滌，再經過梯度酒精脫水、二甲苯透化、封片、晾干之后，放于顯微鏡下觀察分析。

1.3.7統(tǒng)計學處理：應用Graphpad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗對4組數據進行比較。

2　結　果

1.神經損傷評分：正常組與假手術組之間(神經損傷評分、大腦梗死體積、尼氏染色)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與正常組比較，tMCAO組小鼠出現嚴重程度的神經缺損性癥狀，表現在小鼠行走嚴重障礙，向對側傾倒，缺血對側前后肢屈曲，按照LONGA法評分，tMCAO模型組得分(3.40±0.24)分(n=8)。與tMCAO組比較，tMCAO+NAD+組小鼠神經缺損性癥狀明顯減輕，小鼠可曲線行走，僅向對側轉圈，行為學評分顯著下降至(2.10±0.33)分(n=8)。

2.大腦梗死體積及細胞數量：我們利用腦切片HE染色法評價大腦組織壞死情況。正常組小鼠大腦無損傷，HE著色均勻(圖2)；tMCAO組腦組織出現嚴重壞死，缺血區(qū)細胞核急劇減少，HE著色淡(圖2)；NAD+組腦組織壞死體積顯著減少(圖2)。利用數學模型估算出小鼠腦梗死的體積(圖2)，tMCAO組小鼠腦梗死體積約為43.26 mm3，NAD+組小梗死體積下降至25.69 mm3。正常組小鼠大腦神經細胞豐富，尼氏染色顯示較多神經細胞(圖3組)；tMCAO組腦組織出現嚴重壞死，尼氏染色顯示神經細胞明顯減少(圖3組)；tMCAO+NAD+組腦組織神經細胞明顯增加(圖3組)。利用數學模型估算出小鼠腦組織神經細胞存活數量(圖3)，正常組小鼠腦組織單位體積神經細胞存活數量約為1.48×105/mm3；tMCAO組小鼠腦組織單位體積神經細胞存活數量約為0.65×105/mm3；NAD+組小鼠腦組織單位體積神經細胞存活數量約為1.25×105/mm3。

圖1 tMCAO組和tMCAO+NAD+神經損傷評分 按照LONGA法評分對小鼠神經損傷評分,tMCAO組行為學得分3.40±0.24(n=8);tMCAO+NAD+組行為學得分2.10±0.33(n=8)

圖2 tMCAO組和tMCAO+NAD+組梗死體積 A:正常組小鼠腦切片;B:tMCAO組,著色淡;C:tMCAO+NAD+組,梗死組織明顯減少;D:數學模型計算出的2組的梗死體積;與tMCAO+NAD+組比較,*P<0.01

3.尼氏小體：結果發(fā)現，tMCAO小鼠梗死核心區(qū)尼氏小體急劇減少(圖2B，2b)，在其半暗帶區(qū)，尼氏小體數量較正常組顯著減少(如圖2D，2d)，表明蛋白合成能力下降，意味著神經細胞受到嚴重損傷。

圖3 正常組、tMCAO組和tMCAO+NAD+組單位體積內神經細胞數量 A:正常組小鼠腦切片神經細胞數量(HE染色×40倍);tMCAO組單位體積內神經細胞數量明顯減少(HE染色×40倍);tMCAO+NAD+組單位體積內神經細胞數量較tMCAO組明顯增加(HE染色×40倍);B:數學模型計算出的三組的神經細胞存活數量;與tMCAO組比較,*P<0.01

我們進一步發(fā)現給藥NAD+，梗死核心區(qū)細胞數高于tMCAO模型組，低于正常組(圖2C，2c)，在半暗帶區(qū)尼氏小體細胞數高于tMCAO組，低于正常組(圖2E，2e)；結果提示，缺血再灌注損傷對神經細胞蛋白合成功能有嚴重影響，NAD+對蛋白功能損傷有保護效果。

圖4 正常組、tMCAO組和tMCAO+NAD+組尼氏小體數目 A,B,C,D,E為5X物鏡,a,b,c,d,e為20X物鏡。A,a為正常組,尼氏小體豐富;B,b為tMCAO組缺血核心區(qū),尼氏小體急劇減少;C,c為tMCAO+NAD+組缺血核心區(qū),尼氏小體數目上調;D,d為tMCAO組半暗帶區(qū)域,靠近缺血測尼氏小體數目減少;E,e為tMCAO+NAD+組半暗帶區(qū)域,尼氏小體數目較tCMAO組回調

3　討　論

NAD+不僅是經典的能量代謝調控分子[10-11]，而且還參與介導細胞死亡和其他多種生物學過程，由于 NADH/NAD+是細胞還原勢能的標識，因此它在細胞許多氧化還原反應中扮演重要的作用[12]。有研究提示NAD+對腦卒中后的腦損傷具有保護作用，也研究證明NAD+能夠減少氧化應激誘導的神經元和星形膠質細胞的死亡[13-14]。有關腦缺血的動物模型研究發(fā)現在暫時性局部腦缺血的動物模型中通過鼻腔給予NAD+能顯著減少缺血性腦損傷：在缺血開始2 h后給予NAD+能有效減小水腫形成，并且可以抑制腦缺血誘導的皮質和海馬細胞自噬作用，從而可以減輕缺血性腦損傷[15]。同時也有研究表明NAD+能減少由于DNA烷化試劑、軸突損傷、OGD和鋅離子等刺激導致的神經細胞死亡[14]。

本研究重點探討NAD+對成年雄性小鼠發(fā)生腦缺血再灌注后的腦保護作用。

通過選取易于麻醉和控制、腦血管解剖和生理機能和人類相似、實驗重復性好的小鼠作為實驗對象，建立小鼠短暫性局灶性腦缺血再灌注模型來探討腦血管疾病的發(fā)病早期內NAD+對腦組織的保護作用。tMCAO模型有不開顱、準確控制缺血和再灌注時間等優(yōu)點，目前普遍認為是短暫性局灶性腦缺血再灌注模型的標準模型。

為了探討NAD+對tMCAO小鼠模型的腦保護作用，本研究采用觀察神經損傷行為學評分、腦組織梗死體積、單位體積腦組織內神經細胞數量、尼氏染色后尼氏小體數量等評估不同處理小鼠的腦損傷程度。

本實驗建立小鼠tMCAO模型，觀察到缺血性腦卒中發(fā)生早期(48 h)，與正常組比較，tMCAO組小鼠出現嚴重的神經缺損癥狀，同時腦組織出現嚴重病理變化，腦梗死體積增大，單位體積腦組織內神經細胞數量減少，尼氏小體減少；tMCAO+NAD+組與tMCAO組比較，小鼠神經功能缺損程度明顯減輕，梗死體積減小，單位體積腦組織內神經細胞數量增多，尼氏小體較多。這與其他關于NAD+腦保護作用的研究結果[15]基本一致，也再次證明了NAD+對缺血性腦損傷有保護作用。

腦缺血過程是一個復雜的病理過程，它會導致腦內發(fā)生多種變化，如氧化應激的產生、能量的耗竭、離子流的平衡被打破等。通?；钚匝?ROS)和自由離子的不平衡導致的氧化應激被認為是導致缺血性腦損傷的主要因素之一。在腦缺血再灌注過程中 ROS可通過多個途徑產生。NAD+不僅是經典的能量代謝調控分子[10-11]，還參與介導細胞死亡和其他多種生物學過程。研究表明細胞內NAD+的剝奪可以介導 RARP-1 誘導的細胞死亡，NAD+的水平也影響細胞抗氧化能力和氧化應激的產生。由于 NADH/NAD+是細胞還原勢能的標識，因此它在細胞許多氧化還原反應中扮演重要的作用[12]。此外， NAD+可以通過丙酮酸脫氫酶來抑制 ROS 的產生。有研究證明NAD+能夠減少氧化應激誘導的神經元和星形膠質細胞的死亡[13-14]。

本研究結果證明了NAD+對缺血性腦損傷有保護作用。NAD+有可能成為治療缺血性腦卒中的一個新靶點。今后需在NAD+對缺血性腦損傷保護作用的具體機制研究方面進一步深入。

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(2016-03-01收稿)

Treatment of NAD+protects transient middle cerebral artery occlusion in the mouse model of tMCAO

ChenXin,WeiZhenyu,YueDandan,etal.

DepartmentofNeurology,theThirdPeople'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201999

ObjectiveTo explore the effect of NAD+treatment for AIS in the mouse model of transient focal brain ischemia(tMCAO). MethodsAnimals was divided into control group, sham group, tMCAO group and tMCAO+NAD+group. tMCAO model was generated by nylon suture method. We built the tMCAO+NAD+group by the intra-peritoneal injection NAD+50 mg/kg immediately after reperfusion. The behaviour was quantified 48hours later. HE-staining was performed to compared pathological changes and infarct volumes by, meanwhile, nissl staining was used to detect the Nissl changes. ResultsCompare to the sham group, 48hours after ischemia, severe damages were determined in tMCAO group, including pathological changes, increasing infarct volumes, decreaseing of neurones and Nissl signals. compared to the the tMCAO group,the tMCAO+NAD+group had significant decreases of infarct volumes(P<0.01), less neurological deficits(P<0.05) and more neurones and the Nissl signals. ConclusionOur study indicated the protective effort of NAD+for brain after transient middle cerebral artery occlusion.

Reperfusion injuryNAD+Protection

寶山區(qū)科委基金(11-E-3)；上海交通大學醫(yī)學院基金(13×J10030)

201999上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院神經內科[陳昕魏珍玉岳丹丹潘杰吳丹紅(通信作者)]；上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院腦病科(鐘萍)

R743

A

1007-0478(2016)05-0318-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.05.003