侯婧瑛， 凌 輝， 金小巖， 羅 信， 李楚強(qiáng)， 王凌云△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1急診科， 2消化內(nèi)科， 3綜合科， 廣東 廣州 510120)

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)的表達(dá)異常與多種疾病尤其是腫瘤密切相關(guān)[1-2]。，其可通過染色體重塑、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工等不同層面參與基因表達(dá)調(diào)控[3-4]。微小RNA (microRNA， miRNA，miR)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)近乎完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平發(fā)揮對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。有證據(jù)表明lncRNA與miRNA之間的相互調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色[5]。有靶向結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA可以與miRNA形成競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)從而抑制miRNA對靶基因表達(dá)的調(diào)控[3,6]。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是lncRNA 家族的一個重要成員。有證據(jù)顯示MALAT1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了胃癌的侵襲、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[7]。miR-570-3p則對一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[8]。有研究表明miR-570-3p能夠通過調(diào)控與腫瘤免疫相關(guān)的靶基因參與影響胃癌的臨床病理進(jìn)程包括分化、腫瘤侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[9]。在本研究中，我們觀察lncRNA-MALAT1對胃癌細(xì)胞增殖的影響并探討其是否通過靶向下調(diào)miR-570-3p而發(fā)揮調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞系和試劑

胃癌細(xì)胞株SGC7901(中南大學(xué)細(xì)胞庫)；293T 細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(HyClone)；CellTiter 96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Promega)；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMRNAiMAX和Lipofectamine 2000(Invitrogen)；lncRNA-MALAT1 siRNA(si-MALAT1)及其陰性對照(si-MALAT1 negative control,si-MALAT1-NC)、miR-570-3p模擬物(miR-570-3p mimic)和抑制劑(miR-570-3p inhibitor)及陰性對照序列(廣州銳博生物科技有限公司)；QuickMutationTM基因定點(diǎn)突變試劑盒(碧云天)；DpnI酶 (Promega)；psiCHECK-2 雙螢光素酶報告基因載體、螢光素酶檢測試劑盒和Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)。

2 實驗分組和相關(guān)序列信息

2.1細(xì)胞實驗 將體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株SGC7901分為：空白對照(blank control)組：單純的SGC7901細(xì)胞株；si-MALAT1組：轉(zhuǎn)染si-MALAT1；si-MALAT1 NC組：轉(zhuǎn)染si-MALAT1 NC。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：以每孔5×104的密度接種細(xì)胞，充分搖勻。第2天細(xì)胞融合度為40%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。吸去完全培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，每孔加入1 mL 含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；用RNase-free的去離子水溶解siRNA至終濃度為20 μmol/L，將siRNA溶于500 μL Opti-MEM中，混勻、靜置，為A管；將5 μL LipofectamineTMRNAiMAX 加入500 μL Opti-MEM中，輕輕混勻、靜置，為B管；將A管和B管混合，混勻、靜置20 min，分別加入各孔中；并孵育4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基?；靹颍湃爰?xì)胞培養(yǎng)箱；4～6 h后，吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。

2.2螢光素酶報告實驗 設(shè)立lncRNA-MALAT1野生型(MALAT1-WT)和突變型(MALAT1-Mut)，其中各型又分為5組：blank control組(單純的293T細(xì)胞)、miR-570-3p mimic組、miR-570-3p mimic陰性對照(NC mimic)組、miR-570-3p inhibitor組和miR-570-3p inhibitor陰性對照(NC inhibitor)組。

3 方法

3.1MTS實驗 各組胃癌細(xì)胞培養(yǎng)不同時點(diǎn)后消化細(xì)胞，吹散細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/L再接種到96孔板，每孔100 μL(每孔細(xì)胞為1×104)，待細(xì)胞貼壁后再收集進(jìn)行檢測。在各個時點(diǎn)(0、24、48和72 h)收集細(xì)胞之后加入CellTiter 96 AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑(比例10 ∶1，即100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL檢測液)，孵育4 h后用Multiscan MK3酶標(biāo)儀讀板，讀取A490值。

3.2RT-qPCR 檢測 轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，加入1 mL TRIzol溶液裂解提取總RNA，并采用核酸蛋白分析儀以及1.6%瓊脂糖電泳對提取的總RNA進(jìn)行分析。取8 μL總RNA液，70 ℃水浴5 min后加入17 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，再在42 ℃孵育60 min終止反應(yīng)，留取產(chǎn)物后待用。RT-qPCR 擴(kuò)增參數(shù)： 95 ℃ 10 min(1個循環(huán))； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s(40個循環(huán))；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，軟件自動計算定量結(jié)果，具體引物序列信息詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3.3lncRNA-MALAT1表達(dá)載體及其突變載體構(gòu)建 分析MALAT1基因序列，序列號為NR_002819.4，基因全長8 779 bp。采用RegRNA 2.0預(yù)測MALAT1與miR-570-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)(集中在第2 000～5 000 bp位置)，由蘇州金唯智公司合成第2 000～5 000 bp片段，并在合成的片段上、下游引入XhoI酶切位點(diǎn)和NotI酶切位點(diǎn)，將合成的片段和psiCHECK-2載體雙酶切，在T4DNA連接酶的作用下，將MALAT1片段構(gòu)建到psiCHECK-2 載體的多克隆位點(diǎn)處[4]。XhoI酶切位點(diǎn)和NotI酶切位點(diǎn)見表2中下劃線標(biāo)注部分所示。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒提取并酶切鑒定陽性克隆，送陽性質(zhì)粒測序(從載體多克隆位點(diǎn)上游載體骨架處測序)。MALAT1突變采用點(diǎn)突變試劑盒，分別點(diǎn)突變4個位點(diǎn)，具體引物序列見表2所示，PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃ 3 min； 98 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s、68 ℃ 5 min(20個循環(huán)); 68 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過DpnI酶切，37 ℃消化4 h以去除含甲基化的模板DNA。將經(jīng)過DpnI處理的PCR產(chǎn)物純化回收，測序。測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對確認(rèn)MALAT1以及MALAT1-Mut已成功克隆至psiCHECK-2載體中，上述野生型和突變型測序引物詳見表3。

3.4陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染 雙螢光素酶報告實驗中采用293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)方法詳見課題組前期參考文獻(xiàn)[4]。轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞按每孔2×104的密度接種于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基測定24孔板上。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞匯合度約為70%～80%，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后每孔加入300 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中；每個孔用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000 1 μL，終體積為50 μL，室溫下靜置5 min；每個孔加入20 μmol/L的miRNA 1 μL或miRNA抑制劑和0.5 μg質(zhì)粒，再加入Opti-MEM至總體積50 μL，室溫下靜置5 min；(最終孵育液中為50 nmol/L miRNA或100 nmol/L miRNA抑制劑)復(fù)合上述2個步驟中的稀釋液，室溫下靜置20 min；每孔加入100 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合液，晃動24孔板稍加混勻；在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，用新鮮的完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)替換含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基[4]。

3.5螢光素酶活性檢測 用Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1910)進(jìn)行樣品螢光素酶活性檢測。 轉(zhuǎn)染48 h后，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔細(xì)胞加入100 μL PLB (Passive Lysis Buffer)，室溫輕微振搖15 min，收集細(xì)胞裂解液。將20 μL細(xì)胞裂解液加入發(fā)光板后，用GloMax生物發(fā)光檢測儀讀取背景值2 s，每樣品加入100 μL LAR II工作液，快速混勻，讀值2 s。讀值完畢后，每樣品再加入100μL Stop & Glo?Reagent，快速混勻后，放入發(fā)光檢測儀中，讀值2 s。以上每個樣本重復(fù)3次，記錄結(jié)果和保存數(shù)據(jù)[4]。

表2 引物序列

表3 測序引物序列

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，報告基因分析中多組之間的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MALAT1對胃癌細(xì)胞增殖的影響

MTS檢測結(jié)果顯示，si-MALAT1組細(xì)胞在體外培養(yǎng)24、48和72 h的A490值均低于si-MALAT1 NC組和空白對照組(P<0.01)，見圖1，表明lncRNA-MALAT1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

Figure 1.Detection of gastric cancer cell proliferation in each group. Mean±SD. n=3.**P <0.01 vs blank control and si-MALAT1 NC group.

2 不同時點(diǎn)miR-570-3p表達(dá)量變化情況

檢測單純的SGC7901細(xì)胞株培養(yǎng)不同時點(diǎn)miR-570-3p表達(dá)量變化情況，結(jié)果顯示，隨著時間的推移，miR-570-3p的表達(dá)量呈明顯的動態(tài)下降趨勢(P<0.01)，見圖2，提示miR-570-3p的表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

Figure 2.The miR-570-3p expression in pure SGC7901 gastric cancer cell cultured in vitro at different time points Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h.

3 lncRNA-MALAT1和miR-570-3p表達(dá)的關(guān)系

si-MALAT1組lncRNA-MALAT1的表達(dá)量較si-MALAT1 NC組和空白對照組明顯降低(P< 0.01);而si-MALAT1組miR-570-3p的表達(dá)量較si-MALAT1 NC組和空白對照組明顯升高(P<0.01)，見圖3，表明抑制lncRNA-MALAT1后miR-570-3p表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)。

Figure 3.The MALAT1 and miR-570-3p expression in the gastric cancer cells in each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs blank control group and si-MALAT1 NC group.

4 psiCHECK-2-MALAT1雙螢光素酶報告基因載體的酶切鑒定和測序

采用RegRNA 2.0分析MALAT1基因序列，確定與miR-570-3p潛在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。psiCHECK-2-MALAT1野生型和psiCHECK-2-MALAT1突變型酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示，目的基因MALAT1和其突變型均已成功轉(zhuǎn)入psiCHECK-2 載體中，見圖5，其中MALAT1(3 000 bp)在相應(yīng)的位置切出一條目的條帶(5A箭頭所指)，psiCHECK-2-MALAT1雙螢光素酶報告基因載體構(gòu)建成功。

Figure 4.Binding sites of miR-570-3p and lncRNA-MALAT1.

Figure 5.Endonuclease digestion and sequencing of the constructed recombinant plasmids. A: the result of enzyme digestion analysis; B and C: the sequencing analysis of the 2 565～2 594 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively; D and E: the sequencing analysis of the 3 040～3 062 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively; F and G: the sequencing analysis of the 3 503～3 524 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively; H and I: the sequencing analysis of the 4 382～4 408 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively.

5 Promega 雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果

雙螢光素酶報告基因檢測顯示，miR-570-3p模擬物與MALAT1野生型和突變型報告基因共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，miR-570-3p模擬物組MALAT1野生型的雙螢光素酶活性與miR-570-3p模擬物組陰性對照組相比螢光素酶活性明顯降低(P<0.01)，而miR-570-3p抑制劑組MALAT1野生型雙螢光素酶活性與miR-570-3p抑制劑陰性對照組相比明顯增強(qiáng)(P<0.01)； miR-570-3p模擬物、miR-570-3p抑制劑、miR-570-3p模擬物陰性對照、miR-570-3p抑制劑陰性對照對MALAT1突變型的螢光素酶活性無明顯影響，見圖6。

Figure 6.The results of Promega dual-luciferase reporter assay. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic group; ##P<0.01 vs NC inhibitor group.

討 論

表觀遺傳和非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃避方面起著重要作用[10]。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在不同層面廣泛參與機(jī)體多種生物學(xué)功能的調(diào)控，其中包括對基因表達(dá)的遺傳和表觀遺傳調(diào)控、基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)的形成以及對干細(xì)胞多能性和體細(xì)胞重編程的調(diào)控等[3-4]。有證據(jù)表明lncRNA不僅在正常細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中同樣表現(xiàn)出諸多潛在的作用[1-2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中普遍存在異常的lncRNA表達(dá)譜[11]。miRNA在腫瘤領(lǐng)域的研究目前已經(jīng)不斷深入。既往研究表明miRNA參與了多種腫瘤的調(diào)控。miRNA 在各種惡性腫瘤中存在表達(dá)量上的差異性，其特異性表達(dá)調(diào)節(jié)了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[12]。近年來關(guān)于miRNA 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及診斷和治療等方面的相關(guān)研究亦不斷涌現(xiàn)。現(xiàn)已證實lncRNA可作為ceRNA通過miRNA 應(yīng)答元件(miRNA response element，MRE)競爭結(jié)合具有相同MRE 的miRNA來調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞的功能[3-4]，并且這種調(diào)控機(jī)制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[5]。

lncRNA-MALAT1首先在非小細(xì)胞肺癌被發(fā)現(xiàn)并引起關(guān)注。lncRNA-MALAT1定位于染色體11q13.1，在哺乳動物進(jìn)化中高度保守，核苷酸序列3’ 末端 5 kb 左右人鼠同源性高達(dá)90%，提示其在進(jìn)化過程中扮演了重要角色[13]。多項研究表明lncRNA-MALAT1在胃癌中的表達(dá)增高與腫瘤的侵襲、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。LncRNA-MALAT1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的擴(kuò)增[14]，其亦可通過抑制凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而增加胃癌細(xì)胞的腫瘤源性和侵襲性[15]；另發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1能夠作用于腫瘤抑制因子進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]；此外，lncRNA-MALAT1還通過正向調(diào)節(jié)血管形成進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]；已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1高表達(dá)與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、近處轉(zhuǎn)移以及總體生存率相關(guān)[18]。由此可見，lncRNA-MALAT1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中均扮演著至關(guān)重要的角色。在本研究中，與既往報道相一致，我們發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA-MALAT1在胃癌SGC7901細(xì)胞株的表達(dá)后，細(xì)胞不同時點(diǎn)的增殖能力顯著下降，表明lncRNA-MALAT1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

目前已有報道lncRNA-MALAT1可作為ceRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7,19-20]。miR-570-3p被證實與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其能夠抑制一些腫瘤的侵襲性并降低惡性腫瘤的死亡風(fēng)險。miR-570-3p的遺傳突變與膽囊癌的易感性及治療預(yù)后相關(guān)[21]。研究顯示miR-570-3p能夠抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的擴(kuò)增和糖代謝[8]，另有報道m(xù)iR-570-3p表達(dá)增高能顯著降低直結(jié)腸癌的死亡風(fēng)險[22]。既往已有一些關(guān)于miR-570與胃癌的相關(guān)研究報道，如miR-570-3p能夠通過下調(diào)腫瘤免疫相關(guān)因子的表達(dá)影響胃癌的臨床病理進(jìn)程包括分化，腫瘤侵襲性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-570-3p與胃腺癌的臨床病理特征包括分化階段、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均相關(guān)[23]。在本研究中，為明確lncRNA-MALAT1是否能夠通過靶向下調(diào)miR-570-3p參與調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，我們在體外培養(yǎng)的單純SGC7901胃癌細(xì)胞株中檢測了不同時點(diǎn)miR-570-3p表達(dá)量的變化情況，結(jié)果顯示隨著細(xì)胞增殖率的逐漸增加，miR-570-3p表達(dá)呈明顯的動態(tài)下降趨勢，提示miR-570-3p的表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，我們檢測了不同實驗組lncRNA-MALAT1和miR-570-3p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在采用siRNA抑制lncRNA-MALAT1的表達(dá)后，miR-570-3p表達(dá)顯著上調(diào)，表明lncRNA-MALAT1能夠抑制miR-570-3p的表達(dá)。我們進(jìn)一步通過生物信息學(xué)網(wǎng)站RegRNA 2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA-MALAT1和miR-570-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含MALAT1野生型和突變型質(zhì)粒的雙螢光素酶報告載體，并用雙螢光素酶報告基因檢測分析MALAT1與miR-570-3p之間的靶向關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，miR-570-3p模擬物組MALAT1野生型報告基因的螢光素酶活性顯著降低，miR-570-3p抑制劑組MALAT1野生型報告基因的螢光素酶活性則明顯增加；而miR-570-3p模擬物、miR-570-3p抑制劑及其陰性對照對MALAT1突變型的螢光素酶活性均無明顯影響。以上充分說明了lncRNA-MALAT1能夠直接靶向結(jié)合并下調(diào)miR-570-3p。

綜合以上，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1能夠靶向結(jié)合并下調(diào)miR-570-3p進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。本研究為胃癌的診斷治療以及預(yù)后判斷提供了一個新的靶點(diǎn)和突破口。