吳杏兒， 鄭 磊， 孫世珺

(1中山市人民醫(yī)院分子診斷中心， 廣東 中山 528403； 2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科， 廣東 廣州 510515)

脂代謝異常與2型糖尿病密切相關，血脂異?？沙霈F于糖尿病前期，成為促進2型糖尿病發(fā)病的因素之一[1]。血循環(huán)中游離脂肪酸(free fatty acids，FFAs)升高對胰島β細胞的損害，一方面表現為長期脂毒性導致胰島素分泌功能減退[2]，另一方面則表現為引起胰島β細胞數量明顯減少。動物及人類成體胰島β細胞數量的維持依賴于細胞增殖及凋亡平衡[3]。體外實驗發(fā)現， FFAs對嚙齒類動物及人的胰島β細胞同時產生誘導凋亡及抑制增殖的效應[4-5]。迄今已有大量研究闡釋FFAs如何誘導β細胞凋亡，例如在多種不同來源的胰島β細胞中神經酰胺通路已被證實與β細胞凋亡關系緊密[4]; FFAs介導線粒體膜損傷導致一系列細胞因子(如細胞色素C)釋放，可誘導β細胞凋亡[6]。然而，FFAs抑制胰島β細胞增殖的機制尚不清楚。進一步研究FFA抑制胰島β細胞增殖的可能機制，不僅對了解脂毒性參與糖尿病發(fā)病和發(fā)展有所幫助，更有助于未來可能的藥物開發(fā)甚至治療策略的改進。

Wnt信號通路是一類參與調節(jié)器官發(fā)育和細胞有絲分裂等多方面的重要信號通路，該通路不同層面的信號分子，包括Wnt配體及其受體，如卷曲蛋白受體(Frizzled receptors)和受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor，Ror)等在胰腺組織中均有不同程度的表達[7]。我們的前期研究發(fā)現，Wnt配體家族成員之一Wnt5a在β細胞系及小鼠胰島中基礎表達豐度高，并可顯著抑制β細胞增殖[8]。然而，在不同類型的組織細胞中Wnt5a對細胞增殖的影響截然不同，這種現象可能是因為Wnt5a與不同受體結合將激活不同的信號通路[9]，因此明確β細胞中介導Wnt5a調控細胞增殖的受體類型具有重要意義。體外實驗中，我們發(fā)現受體Frizzled-2(Fzd-2)及Ror-2可介導Wnt5a激活鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)通路，從而下調細胞周期因子cyclin D1表達，最終抑制β細胞增殖。近來研究發(fā)現Fzd-2與脂代謝異常密切相關，Fzd-2介導Wnt5a參與調控脂肪性肝硬化發(fā)展過程[10]。但受體Fzd-2及Ror-2是否參與介導脂毒性抑制胰島β細胞增殖，目前尚無相關報道。因此本實驗采用飽和脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid, PA)刺激大鼠胰島β細胞系INS-1，采用RT-qPCR、Western blot及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技術，檢測棕櫚酸對INS-1細胞Fzd-2和Ror-2表達的調控作用，并運用siRNA干擾受體Fzd-2及Ror-2表達，再予棕櫚酸刺激，采用EdU標記法明確受體Fzd-2及Ror-2在棕櫚酸抑制INS-1細胞增殖中的作用，為探索脂毒性抑制β細胞增殖機制提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要材料

大鼠胰島β細胞系INS-1購自ATCC。小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；棕櫚酸、BSA、2-巰基乙醇、HEPES和二甲基亞砜購自Sigma；siRNA由廣州吉捷生物科技有限公司合成提供；EdU試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司；轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen；羊抗人Fzd-2抗體(交叉抗大鼠)購自Abcam；兔抗人/鼠Ror-2抗體、兔抗鼠Wnt5a抗體和兔抗鼠GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；抗Wnt5a單克隆抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化酶標記IgG購自弗德生物技術有限公司；Pierce Direct IP Kit試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；EastepTM通用型總RNA提取試劑盒、GoScriptTM反轉錄試劑盒和GoTaq?qPCR Master Mix購自Promaga。熒光定量PCR儀7500購自ABI；倒置熒光顯微鏡購自Olympus。所有引物均由Invitrogen合成。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 將INS-1細胞培養(yǎng)在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中，每100 mL細胞培養(yǎng)液含有10%小牛血清、1%青/鏈霉素、2-巰基乙醇貯存液35 μL、碳酸氫鈉0.2 g和10 μmol/L HEPES 0.1 mL。以含0.25%胰酶消化細胞傳代，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液。

2.2EdU標記染色法檢測細胞增殖率 細胞分為無意義siRNA轉染+溶劑BSA(陰性對照，negative control， NC)組、無意義siRNA轉染+棕櫚酸(NC+PA)組和siRNA-Fzd-2/Ror-2轉染+棕櫚酸組(針對Fzd-2和Ror-2各設置2組不同有效序列siRNA轉染)。轉染36 h后予500 μmol/L棕櫚酸繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

各組細胞以每孔4×104的密度種植至鋪有蓋玻片的24孔板，細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，進行轉染或共培養(yǎng)，離觀察終點2 h前往培養(yǎng)基中加入EdU溶液(終濃度為50 μmol/L)，按試劑盒說明固定細胞、染色及鋪片。使用倒置熒光顯微鏡，觀察Appolo 567染色使用550 nm激發(fā)光，觀察Hoechst 33342染色使用350 nm激發(fā)光，放大倍數為400。每復孔等分4象限，每象限隨機拍攝3張不同視野照片均計數，分別計算Hoechst(細胞核)及Appolo(增殖細胞)染色細胞數，Appolo/Hoechst比值為細胞增殖率，每復孔Hoechst染色陽性細胞計數>1 000個。同組設3個復孔，取增殖率平均數及標準差。

2.3細胞轉染 除按照EdU標記實驗的分組外，另設無意義siRNA轉染組、siRNA-Fzd-2-1轉染組、siRNA-Fzd-2-2轉染組、siRNA-Ror-2-1轉染組和siRNA-Ror-2-2轉染組。按LipofectamineTM2000轉染試劑盒操作說明，分別將含有1 μg無意義siRNA、siRNA-Fzd-2-1(5’-UGCAUCAAUUCUACCCGCUGGUGAAd-Td-3’，5’-UUCACCAGCGGGUAGAAUUGAUGCAdTd-3’)、siRNA-Fzd-2-2(5’-CGUCCUAUCUCAGCUAU-AAGUUUCUdTd-3’， 5’-AGAAACUUAUAGCUGAGA-UAGGACGdTd-3’)、siRNA-Ror-2-1(5’-CCAUUGACACCUUGGGACAACUUGAdTd-3’，5’-UCAAGUUGU-CCCAAGGUGUCAAUGGdTd-3’)及siRNA-Ror-2-2(5’-CCAUUACCGCCACUGGUGUUCUGUAdTd-3’，5’-UA-CAGAACACCAGUGGCGGUAAUGGdTd-3’)的稀釋液加入含無血清培養(yǎng)基的EP管中混勻，緩慢加入含1 μL LipofectamineTM2000的50 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置20 min形成轉染復合物。使用轉染復合物培養(yǎng)細胞6～8 h后吸出轉染復合物，換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集細胞用于Western blot檢測或EdU標記染色進行細胞增殖率計數。

2.4免疫共沉淀 按Pierce Direct IP Kit試劑盒說明將抗Wnt5a單克隆抗體通過共價偶聯結合到瓊脂糖樹脂。細胞經BSA或200 μmol/L棕櫚酸刺激6 h后棄培養(yǎng)液，用試劑盒中1×Coupling Buffer洗滌細胞1次，冰上操作加入IP裂解液裂解5 min，裂解物轉移至離心管中13 000×g離心10 min，轉移上清至離心管中，留取部分進行蛋白定量及Western blot分析，其余按試劑盒說明進行免疫共沉淀。免疫沉淀反應后，按試劑盒說明用洗脫緩沖液洗脫蛋白，室溫孵育10 min后離心收集洗脫液，用于后續(xù)Western blot分析。

2.5RT-qPCR實驗 細胞共分5組：BSA溶劑對照組及200 μmol/L棕櫚酸刺激3 h、6 h、12 h和24 h組。按試劑盒說明于冰面操作提取對數生長期細胞總RNA，再反轉錄為cDNA。按試劑盒說明進行反轉錄，反應條件：25 ℃退火5 min，延伸1 h，70 ℃滅活15 min。cDNA樣本-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-qPCR反應總體系為20 μL，包括反轉錄產物樣本5 μL、無酶核酸水4 μL、引物0.8 μL、Master Mix (2×)10 μL和CXR(100×)0.2 μL。反應條件： 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 1 min(40個循環(huán))。Fzd-2及Ror-2相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算，內參照為β-actin。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.6Western blot實驗 時間梯度實驗分6組：BSA溶劑對照組及200 μmol/L棕櫚酸刺激1 h、3 h、6 h、12 h和24 h組；濃度梯度實驗分4組：BSA溶劑對照組及200、500和1 000 μmol/L棕櫚酸刺激6 h組。至觀察終點棄去培養(yǎng)基加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白。12% SDS-PAGE分離蛋白質，轉膜，4% BSA封閉2 h，PBS洗膜3次后加 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次加 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后再在暗室中加入發(fā)光劑，顯影后定影。以GAPDH為內參照，ImageJ軟件灰度掃描圖像檢測Fzd-2及Ror-2蛋白表達的差異。

3 統計學處理

采用SPSS 11.0統計軟件處理數據。每組設置3次重復獨立實驗，結果均以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 棕櫚酸誘導INS-1細胞受體Fzd-2和Ror-2的mRNA表達

RT-qPCR檢測結果顯示，經棕櫚酸刺激后INS-1細胞受體Fzd-2及Ror-2 mRNA水平升高。與溶劑對照組相比，細胞自棕櫚酸刺激6 h后Fzd-2的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，且隨刺激時間延長逐漸增加；經棕櫚酸處理3 h后， Ror-2的mRNA表達水平升高，刺激12 h后達峰值(P<0.05)，見圖1。

2 棕櫚酸促進INS-1細胞受體Fzd-2和Ror-2的蛋白表達

Western blot檢測200 μmol/L棕櫚酸處理細胞后Fzd-2及Ror-2蛋白隨時間表達變化，結果顯示INS-1細胞中的Fzd-2及Ror-2蛋白表達水平逐漸增加(P<0.05)，見圖2A；使用不同濃度棕櫚酸刺激細胞6 h，結果顯示細胞Fzd-2及Ror-2的蛋白表達水平隨棕櫚酸刺激濃度升高而增加(P<0.05)，見圖2B。

3 棕櫚酸促進INS-1細胞中Wnt5a與受體Fzd-2、Ror-2結合

Co-IP檢測棕櫚酸刺激下細胞中Wnt5a與受體Fzd-2和Ror-2結合的變化，結果顯示，與BSA溶劑對照組相比，200 μmol/L棕櫚酸刺激6 h可顯著促進Wnt5a募集Fzd-2和Ror-2(P<0.05)，見圖3。

4 沉默Fzd-2和Ror-2表達對棕櫚酸抑制INS-1細胞增殖的影響

siRNA瞬時轉染沉默Fzd-2及Ror-2，轉染36 h后Western blot 檢測結果顯示siRNA序列有效降低Fzd-2和Ror-2表達，見圖4A、B。分別使用siRNA-Fzd-2和siRNA-Ror-2轉染細胞36 h后予500 μmol/L棕櫚酸繼續(xù)刺激細胞24 h，EdU標記法檢測細胞增殖率，結果顯示轉染無意義siRNA的情況下，棕櫚酸顯著降低細胞增殖率(P<0.05)，沉默Fzd-2及Ror-2均能減弱棕櫚酸抑制細胞增殖的效應(P<0.05)，見圖4C、D。

Figure 1.Palmitic acid (PA) activated the mRNA expression of Fzd-2 and Ror-2 in INS-1 cells. INS-1 cells were exposed to 200 μmol/L PA for 3 h, 6 h, 12 h and 24 h, and the mRNA levels of Fzd-2 and Ror-2 were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

Figure 2.Palmitic acid (PA) up-regulated the protein expression of Fzd-2 and Ror-2 in the INS-1 cells. INS-1 cells were exposed to 200 μmol/L PA for the indicated time points (A) or to various concentrations of PA for 6 h (B). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

Figure 3.Palmitic acid (PA) promoted the interaction between Wnt5a and Fzd-2/Ror-2 in INS-1 cells. The cells were treated with BSA or PA (200 μmol/L) for 6 h. The results of co-immunoprecipitation demonstrating the interaction between Wnt5a and Fzd-2/Ror-2. The cell lysates were first immunopurified using monoclonal anti-Wnt5a antibody. Wnt5a and co-immunoprecipitated Fzd-2/Ror-2 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

Wnt信號通路在細胞繁殖和生物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt基因編碼一類分泌型糖蛋白，既可與自身細胞膜受體結合，也可與鄰近細胞的膜受體結合。不同的Wnt蛋白既可起相同作用，也可產生不同的效應[11]。本課題組前期研究通過體內外實驗，發(fā)現GLP-1受體長效激動劑exendin-4促進INS-1細胞及小鼠胰島β細胞增殖過程中，Wnt5a是所有19個Wnt配體中唯一一個基礎表達豐度高但其表達卻隨細胞增殖率升高顯著下調的亞型。我們發(fā)現在INS-1細胞中Wnt5a通過激活非經典Wnt/CaMKⅡ通路抑制β-catenin轉錄活性，下調cyclin D1表達，這揭示了Wnt5a可能是抑制胰島β細胞增殖的重要調控因子。有趣的是，既往文獻報道Wnt5a對不同組織來源細胞增殖活性作用不一。在乳腺上皮細胞和非小細胞肺癌中Wnt5a表現促細胞增殖效應[12-13]；然而在B淋巴細胞瘤和結直腸癌等組織細胞中Wnt5a卻表現為抑制細胞增殖[14-15]。這種復雜作用可能是由于Wnt5a通過結合不同的特異性受體發(fā)揮活性作用引起的[16]。我們的前期實驗發(fā)現了受體Fzd-2及Ror-2均參與介導Wnt5a調控INS-1細胞增殖，并且發(fā)現棕櫚酸可通過調控Wnt5a信號通路抑制β細胞增殖。因此，本實驗中著重關注了Wnt5a受體Fzd-2及Ror-2在棕櫚酸抑制β細胞增殖過程中的作用。

Wnt蛋白的受體Fzd蛋白是一組7次跨膜蛋白，具有與G蛋白偶聯受體相似的結構，廣泛表達于多種器官組織。Fzd蛋白高度保守的富含半胱氨酸配體結合區(qū)是Fzd與Wnt相結合的部位，不同Fzd受體傾向于不同的信號通路。Slusarski等[17]于斑馬魚胚胎異位表達Fzd-2受體及Wnt5a，發(fā)現Wnt5a可通過Fzd-2受體促進胞內鈣釋放。胞內鈣濃度升高激活CaMKⅡ， 有研究者通過體內外實驗證實Wnt5a激活小鼠B淋巴細胞的CaMKⅡ通路下調cylcin D1表達而抑制細胞增殖。然而異位表達大鼠Fzd-1不能增加胞內鈣離子濃度，也無法激活CaMKⅡ。我們的前期實驗發(fā)現，基礎狀態(tài)下Wnt5a經受體Fzd-2介導可激活CaMKⅡ通路抑制INS-1細胞增殖，并發(fā)現Wnt5a參與介導棕櫚酸抑制INS-1細胞增殖。因此本研究使用棕櫚酸刺激INS-1細胞，并檢測細胞Fzd-2 mRNA及蛋白水平的表達變化。鑒于棕櫚酸具有較強的細胞毒性，為避免損失過多細胞以提取足量RNA及蛋白，時間梯度實驗中采用較低濃度(200 μmol/L)棕櫚酸處理細胞；此外前期實驗發(fā)現500 μmol/L棕櫚酸抑制INS-1增殖更為顯著，故siRNA轉染實驗中采用該濃度棕櫚酸刺激細胞。本實驗發(fā)現棕櫚酸在抑制細胞增殖的同時可顯著上調受體Fzd-2的表達，并促進配體Wnt5a募集該受體，提示我們受體Fzd-2作為Wnt5a信號通路的一環(huán)，是介導脂毒性抑制β細胞增殖的重要調控因子。至于Fzd-2是否仍通過介導Wnt5a/CaMKⅡ信號通路參與棕櫚酸抑制β細胞增殖，尚待我們進一步的實驗探索。

Figure 4.The effects of Fzd-2 and Ror-2 silencing on palmitic acid (PA)-induced inhibition of INS-1 cell proliferation. A and B: the protein expression of Fzd-2 and Ror-2 was determined by Western blot analysis; C and D: quantification of EdU incorporation assay and representative images were showed (×400). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs NC+PA group.

本研究首次發(fā)現棕櫚酸可通過調控受體Fzd-2表達抑制INS-1細胞增殖，然而目前尚無相關報道揭示棕櫚酸調控Fzd-2表達的具體分子機制。我們對大鼠Fzd-2基因序列進行啟動子元件分析，發(fā)現在Fzd-2啟動子區(qū)域可能存在與轉錄因子c-Fos結合的序列。Roche等[18]發(fā)現棕櫚酸刺激INS-1細胞可顯著上調c-Fos蛋白表達，這提示棕櫚酸可能通過上調c-Fos轉錄因子的表達促進Fzd-2基因表達。前期實驗中我們發(fā)現棕櫚酸上調INS-1細胞的Wnt5a表達，而前人研究表明Wnt5a可引起胞內鈣釋放，棕櫚酸募集c-Fos又需要胞內鈣濃度升高[18]。這提示我們Wnt5a既是受體Fzd-2的配體，也可能參與介導棕櫚酸調控Fzd-2表達，形成了一個調控網絡。

Ror受體家族是一類Ⅰ型跨膜蛋白酪氨酸激酶，在無脊椎及脊椎動物中基因序列高度保守，其胞外結構具有與Fzd蛋白相似的CRD，也是Ror受體與Wnt蛋白結合的重要區(qū)域。在哺乳類動物中Ror-2受體可與Wnt5a結合，直接抑制依賴β-catenin的經典Wnt信號通路[19]。本課題組前期研究發(fā)現Ror-2參與介導Wnt5a抑制INS-1細胞增殖，Wnt5a信號通路的激活不僅降低全細胞β-catenin濃度，同時也抑制β-catenin與TCF/LEF結合成有效的轉錄復合物，最終下調下游cyclin D1表達。本研究首次報道受體Ror-2參與介導棕櫚酸調控INS-1細胞增殖，棕櫚酸刺激細胞后顯著上調Ror-2 mRNA及蛋白水平的表達，并促進Wnt5a募集 Ror-2，從而抑制細胞增殖。我們的前期研究發(fā)現在介導Wnt5a抑制INS-1增殖的過程中，受體Fzd-2可能比Ror-2占更重要的地位。而本研究中使用siRNA沉默Fzd-2比沉默Ror-2更能顯著地減弱棕櫚酸對細胞增殖的抑制作用。這一現象與我們的前期研究結果相符，并提示在介導棕櫚酸抑制β細胞增殖中Fzd-2受體可能更重要。

綜上所述，本研究首次明確了棕櫚酸通過上調受體Fzd-2及Ror-2表達，并促進其與調控β細胞增殖的重要因子Wnt5a結合，從而抑制INS-1細胞增殖。