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        紫薯花色苷提取物對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化和高脂血癥的作用*

        2018-12-27 09:05:20韋永芳劉寒英嚴(yán)艷花
        中國病理生理雜志 2018年12期
        關(guān)鍵詞:小鼠血清水平

        韋永芳, 劉寒英, 嚴(yán)艷花, 朱 柳

        (廣州醫(yī)科大學(xué) 1實驗動物中心, 2中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)系, 3藥學(xué)院, 廣東 廣州 511436)

        高脂血癥和高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素,也是心血管疾病等發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)。AS是一個多因素共同參與的復(fù)雜疾病,由AS導(dǎo)致的心血管疾病的發(fā)病率及死亡率不斷增加,已成為全球范圍內(nèi)人類主要死因,尋找新的預(yù)防和治療方法勢在必行。流行病學(xué)提示,黃酮類化合物在促進(jìn)健康和防治心血管疾病方面具有良好的療效?;ㄉ?anthocyanins,A)屬于黃酮類植物化學(xué)物,廣泛存在于多種食物中,包括草莓、葡萄和柑橘等漿果類水果,茄子、胡蘿卜和洋蔥等蔬菜,來源廣泛。近年研究顯示花色苷對高脂血癥和AS的發(fā)生發(fā)展起到一定的抑制作用[1-3]。本研究通過高脂飲食(high-fat diet, H)誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠產(chǎn)生AS和高脂血癥,應(yīng)用不同劑量的紫薯花色苷提取物進(jìn)行干預(yù),觀察紫薯花色苷提取物對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化和高脂血癥的作用。

        材 料 和 方 法

        1 實驗動物

        ApoE-/-小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0002,合格證號為44007200036893。動物飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境的動物實驗室[許可證號SYXK(粵)2016-0168],繁育其后代用于實驗。普通飼料和高脂飼料購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司,營養(yǎng)成分見表1。

        表1 普通飼料和高脂飼料主要營養(yǎng)成分及能量構(gòu)成

        2 試劑和儀器

        紫薯(廣紫薯8號,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所)花色苷提取液用浸提法提取,大孔樹脂純化制得紫薯花青素凍干粉, pH示差法測總花色苷,測得每克紫薯花青素凍干粉含總花青素為354 mg);立普妥(lipitor, L;即阿托伐他汀鈣)購自輝瑞制藥有限公司(產(chǎn)品批號R39701);TRIzol、TaqMan Universal PCR Master Mix、PrimeScriptTMRT-PCR Kit和SYBR Green I購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。DP80顯微鏡(Olympus);ABI7900HT熒光定量PCR 儀(ABI)。

        3 方法

        3.1動物分組及處理 雄性SPF級8周齡ApoE-/-小鼠50只,體重17~19 g,飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,隨機(jī)分成5組:對照(normal, N)組、H組、花色苷低劑量(low-dose anthocyanin, A-low)組、花色苷高劑量(high-dose anthocyanin, A-high)組和L組(n=10)。對照組給予普通飼料,其它4組均給予高脂飼料喂養(yǎng)8周,再別給予蒸餾水、紫薯花色苷提取物(1.67 mg·kg-1·d-1和8.35 mg·kg-1·d-1)或立普妥(2 mg·kg-1·d-1)灌胃8周,處死前禁食12 h,不禁水,取各組小鼠的血清、動脈及肝臟進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

        3.2血清脂質(zhì)四項檢測 小鼠麻醉后心臟取血,靜置離心取血清,全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,由廣州市金域檢驗中心測定。

        3.3斑塊面積的測定 生理鹽水灌洗干凈,取出肝臟和動脈血管,一部分組織用于冰凍切片,油紅O染色;另一部分置于4%的中性多聚甲醛溶液中固定后,石蠟包埋后切片,HE染色,經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,計算小鼠的主動脈根部粥樣斑塊相對面積(即斑塊面積與血管腔橫截面積的比值)。

        3.4RT-qPCR檢測主動脈炎癥因子的mRNA表達(dá)水平 用TRIzol提取主動脈和肝臟組織總RNA,紫外分光光度法檢測RNA的濃度,并用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性,確認(rèn)無誤。參照GenBank中靶基因cDNA序列設(shè)計引物(見表2),引物由TaKaRa合成,參考PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)說明書方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)體系由14 μL模板RNA、 2 μL enzyme mix及 5×RT 緩沖液4 μL 組成,42 ℃反應(yīng)1 h,95 ℃反應(yīng)5 min,即得cDNA。采用SYBR Green I熒光定量法檢測主動脈中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α)和內(nèi)參照β-actin的表達(dá)量。RT-qPCR 擴(kuò)增體系為2× SYBR? Premix Ex TaqTMII 5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.2 μL、下游引物(10 μmol/L)0.2 μL、cDNA 1 μL和ddH2O 3.6 μL。用ABI 7900HT 熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性10 min; PCR反應(yīng)95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,40個循環(huán),并添加熔解曲線。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的模板量的對數(shù)和相應(yīng)的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的拷貝數(shù)。以目的基因拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)比值用 2-ΔΔCt表示,計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

        表2 RT-qPCR引物序列

        IL-1β: interleukin-1β; IL-6: interleukin-6; MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1; PPAR-α: peroxisome proliferator-activated receptor-α.

        4 統(tǒng)計學(xué)處理

        用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 血脂水平

        與N組相比,H組小鼠血清TC、LDL-C和HDL-C水平均顯著增加(P<0.01);與H組相比,A-low組血清TC和LDL-C水平顯著降低(P<0.05), A-high組血清TG、TC和LDL-C含量均顯著降低(P<0.01), L組血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見表3。

        表3 ApoE-/-小鼠血脂水平的比較

        #P<0.05,##P<0.01vsN group;*P<0.05,**P<0.01vsH group.

        2 動脈粥樣硬化斑塊面積

        油紅O染色和HE染色顯示,H組、A-low組、A-high組和L組均有明顯AS斑塊形成,可見內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞過度增生,脂質(zhì)沉積,膽固醇結(jié)晶,形成大小不等的大量泡沫細(xì)胞,內(nèi)膜下有巨噬細(xì)胞浸潤,形成明顯的AS斑塊,以H組最為明顯;與H組相比,經(jīng)不同劑量花色苷和立普妥灌胃治療8周后,A-low組、A-high組和L組小鼠主動脈根部的AS斑塊面積明顯減小(P<0.01),A-low、A-high組和L組之間并無顯著差異,見圖1、表4。

        3 肝臟的病理變化

        油紅O染色和HE染色顯示,N組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰,細(xì)胞無脂肪變性;H組肝組織重度脂肪變性,肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不一的脂滴,呈氣球樣變;A-low組肝組織中度脂肪變性,以小脂滴為主;A-high組和L組肝組織輕度脂肪變性,以細(xì)小脂滴為主,見圖2。

        Figure 1.Atherosclerotic plaque lesion in ApoE-/- mice. A: the whole aorta stained with Oil Red O; B: cross-sectional section stained with HE (×50); C: cryostat section of aortic root stained with Oil Red O (×50).

        表4 ApoE-/- 小鼠主動脈根部AS斑塊的相對面積

        ##P<0.01vsN group;*P<0.05vsH group.

        4 炎癥因子的mRNA表達(dá)

        RT-qPCR結(jié)果顯示,高脂飲食后,H組主動脈炎癥因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)明顯增加,肝臟PPAR-α的mRNA表達(dá)明顯減少;經(jīng)花色苷提取物治療后,A-low、A-high和L組主動脈炎癥因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)明顯減少,肝臟PPAR-α的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05),見圖3。

        討 論

        以往的實驗研究發(fā)現(xiàn)[1-3],花色苷及其提取物可以降低心血管疾病和糖尿病等的發(fā)病風(fēng)險,主要歸因于其抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂以及改善內(nèi)皮功能等作用。花色苷類物質(zhì)能降低血清及肝臟中脂肪含量,特別是總膽固醇、低密度脂蛋白水平,花色苷的攝入與AS的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。長期的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),適度的紅酒和果汁提取物等攝入可以降低AS、卒中和外周血管性疾病的發(fā)病率,這與紅酒和果汁提取物中富含花色苷等多種植物化學(xué)物有關(guān)。動物實驗也發(fā)現(xiàn)[4-5],黑米和紅米花色苷能顯著降低家兔血漿TC和TG水平,延遲動脈粥樣斑塊形成;黑米花色苷提取物、紫薯花色苷和黑果枸杞花色苷均能顯著改善ApoE-/-小鼠的血脂水平,減少斑塊面積,抑制AS斑塊的進(jìn)一步發(fā)展[6-10]。而AS斑塊的進(jìn)行性增大將導(dǎo)致血管壁增厚、血管腔變窄,心臟供血減少,更為嚴(yán)重的是脆性斑塊的破裂能夠直接引起急性冠狀動脈綜合征。最近的研究發(fā)現(xiàn)花色苷單體矢車菊素-3-葡萄糖苷可降低血小板相關(guān)炎癥因子,血漿中CCL5水平的變化與炎癥因子IL-1β的變化呈正相關(guān)[11],在體外通過抑制CCL5/CCR5介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞遷移而有效抑制炎癥,證明這可能是花色苷減輕炎癥及抗動脈粥樣硬化發(fā)展的機(jī)制之一[12]。

        Figure 2. The pathological changes of the liver in the ApoE-/-mice. A: HE staining (×200); B: Oil Red O staining (×400).

        Figure 3. The mRNA expression levels of IL-1β, IL-6 and MCP-1 in the aorta, and PPAR-α in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n= 3. # P<0.05, ##P<0.01 vs N group; *P<0.05, **P<0.01 vs H group.

        本研究發(fā)現(xiàn)高脂飼喂小鼠后,H組小鼠血清的TC和LDL-C水平明顯升高,由于脂質(zhì)水平升高,造成肝臟嚴(yán)重脂肪變性,并促使大量脂質(zhì)進(jìn)入動脈壁,在局部沉積聚集,AS的斑塊面積顯著增加。紫薯花色苷提取液干預(yù)后,A-high組血清TG、TC、LDL-C和AS的斑塊面積及肝脂肪變性程度都顯著降低,血清中TG和TC的下降可能有助于減少斑塊以及脂類物質(zhì)在斑塊上的繼續(xù)堆積;同時LDL-C的降低能減少泡沫細(xì)胞的形成,從而抑制AS的發(fā)展。

        AS是多因素共同導(dǎo)致的慢性復(fù)雜炎癥性疾病,多種炎癥介質(zhì)參與AS的發(fā)生發(fā)展[13-15]。炎癥的作用主要依賴于炎癥細(xì)胞的浸潤和促炎因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6和hs-CRP等的產(chǎn)生和釋放,促炎因子對AS的形成和進(jìn)展密切相關(guān)[16]。趨化因子是 AS 斑塊形成及不穩(wěn)定的一個重要介質(zhì),它不僅能啟動淋巴細(xì)胞浸潤進(jìn)入AS病變,還能通過增加巨噬細(xì)胞的基質(zhì)降解、刺激血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織因子以及誘導(dǎo)斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡等機(jī)制促使斑塊破裂和血栓形成,進(jìn)而在斑塊不穩(wěn)定過程中起重要作用,降低AS斑塊中趨化因子的水平和給予趨化因子受體抗體可有效地減少AS發(fā)展[17-19]。本研究也證實,高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平均顯著增高,紫薯花色苷提取液干預(yù)可明顯降低IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平。紫薯花色苷提取液在一定程度上抑制AS病變的發(fā)展,這可能與降低炎癥反應(yīng)相關(guān)。

        PPAR-α的激活可能與脂質(zhì)代謝產(chǎn)物有關(guān)[20-21]。為防止體內(nèi)過多的脂肪堆積,可以通過抑制儲存在脂肪細(xì)胞中的PPAR-α酶調(diào)節(jié),從而分解脂肪。此外PPARα激活可升高內(nèi)皮細(xì)胞的MCP-1和IL-8的表達(dá)水平[22]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠PPAR-α表達(dá)明顯降低,紫薯花色苷提取液干預(yù)提高了PPAR-α表達(dá)水平。

        綜上所述,本研究表明紫薯花色苷提取液能調(diào)節(jié)血脂水平,減少主動脈的斑塊面積,抑制炎癥反應(yīng),延緩AS 斑塊進(jìn)展。這為防治肝脂肪變性及動脈粥樣硬化提供有效的途徑。

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