韋永芳， 劉寒英， 嚴(yán)艷花， 朱 柳

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1實驗動物中心， 2中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)系， 3藥學(xué)院， 廣東 廣州 511436)

高脂血癥和高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素，也是心血管疾病等發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)。AS是一個多因素共同參與的復(fù)雜疾病，由AS導(dǎo)致的心血管疾病的發(fā)病率及死亡率不斷增加，已成為全球范圍內(nèi)人類主要死因，尋找新的預(yù)防和治療方法勢在必行。流行病學(xué)提示，黃酮類化合物在促進(jìn)健康和防治心血管疾病方面具有良好的療效?；ㄉ?anthocyanins，A)屬于黃酮類植物化學(xué)物，廣泛存在于多種食物中，包括草莓、葡萄和柑橘等漿果類水果，茄子、胡蘿卜和洋蔥等蔬菜，來源廣泛。近年研究顯示花色苷對高脂血癥和AS的發(fā)生發(fā)展起到一定的抑制作用[1-3]。本研究通過高脂飲食(high-fat diet, H)誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠產(chǎn)生AS和高脂血癥，應(yīng)用不同劑量的紫薯花色苷提取物進(jìn)行干預(yù)，觀察紫薯花色苷提取物對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化和高脂血癥的作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

ApoE-/-小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0002，合格證號為44007200036893。動物飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境的動物實驗室[許可證號SYXK(粵)2016-0168]，繁育其后代用于實驗。普通飼料和高脂飼料購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，營養(yǎng)成分見表1。

表1 普通飼料和高脂飼料主要營養(yǎng)成分及能量構(gòu)成

2 試劑和儀器

紫薯(廣紫薯8號，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所)花色苷提取液用浸提法提取，大孔樹脂純化制得紫薯花青素凍干粉， pH示差法測總花色苷，測得每克紫薯花青素凍干粉含總花青素為354 mg)；立普妥(lipitor, L;即阿托伐他汀鈣)購自輝瑞制藥有限公司(產(chǎn)品批號R39701)；TRIzol、TaqMan Universal PCR Master Mix、PrimeScriptTMRT-PCR Kit和SYBR Green I購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。DP80顯微鏡(Olympus)；ABI7900HT熒光定量PCR 儀(ABI)。

3 方法

3.1動物分組及處理 雄性SPF級8周齡ApoE-/-小鼠50只，體重17～19 g，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，隨機(jī)分成5組：對照(normal, N)組、H組、花色苷低劑量(low-dose anthocyanin, A-low)組、花色苷高劑量(high-dose anthocyanin, A-high)組和L組(n=10)。對照組給予普通飼料，其它4組均給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，再別給予蒸餾水、紫薯花色苷提取物(1.67 mg·kg-1·d-1和8.35 mg·kg-1·d-1)或立普妥(2 mg·kg-1·d-1)灌胃8周，處死前禁食12 h，不禁水，取各組小鼠的血清、動脈及肝臟進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

3.2血清脂質(zhì)四項檢測 小鼠麻醉后心臟取血，靜置離心取血清，全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,由廣州市金域檢驗中心測定。

3.3斑塊面積的測定 生理鹽水灌洗干凈，取出肝臟和動脈血管，一部分組織用于冰凍切片，油紅O染色；另一部分置于4%的中性多聚甲醛溶液中固定后，石蠟包埋后切片，HE染色，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，計算小鼠的主動脈根部粥樣斑塊相對面積(即斑塊面積與血管腔橫截面積的比值)。

3.4RT-qPCR檢測主動脈炎癥因子的mRNA表達(dá)水平 用TRIzol提取主動脈和肝臟組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA的濃度，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性，確認(rèn)無誤。參照GenBank中靶基因cDNA序列設(shè)計引物(見表2)，引物由TaKaRa合成，參考PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)說明書方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系由14 μL模板RNA、 2 μL enzyme mix及 5×RT 緩沖液4 μL 組成，42 ℃反應(yīng)1 h，95 ℃反應(yīng)5 min，即得cDNA。采用SYBR Green I熒光定量法檢測主動脈中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α)和內(nèi)參照β-actin的表達(dá)量。RT-qPCR 擴(kuò)增體系為2× SYBR? Premix Ex TaqTMII 5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.2 μL、下游引物(10 μmol/L)0.2 μL、cDNA 1 μL和ddH2O 3.6 μL。用ABI 7900HT 熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為: 95 ℃預(yù)變性10 min; PCR反應(yīng)95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個循環(huán)，并添加熔解曲線。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的模板量的對數(shù)和相應(yīng)的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的拷貝數(shù)。以目的基因拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)比值用 2-ΔΔCt表示，計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表2 RT-qPCR引物序列

IL-1β: interleukin-1β; IL-6: interleukin-6; MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1; PPAR-α: peroxisome proliferator-activated receptor-α.

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血脂水平

與N組相比，H組小鼠血清TC、LDL-C和HDL-C水平均顯著增加(P<0.01)；與H組相比，A-low組血清TC和LDL-C水平顯著降低(P<0.05), A-high組血清TG、TC和LDL-C含量均顯著降低(P<0.01), L組血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見表3。

表3 ApoE-/-小鼠血脂水平的比較

#P<0.05,##P<0.01vsN group;*P<0.05,**P<0.01vsH group.

2 動脈粥樣硬化斑塊面積

油紅O染色和HE染色顯示，H組、A-low組、A-high組和L組均有明顯AS斑塊形成，可見內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞過度增生，脂質(zhì)沉積，膽固醇結(jié)晶，形成大小不等的大量泡沫細(xì)胞，內(nèi)膜下有巨噬細(xì)胞浸潤，形成明顯的AS斑塊,以H組最為明顯；與H組相比，經(jīng)不同劑量花色苷和立普妥灌胃治療8周后，A-low組、A-high組和L組小鼠主動脈根部的AS斑塊面積明顯減小(P<0.01)，A-low、A-high組和L組之間并無顯著差異，見圖1、表4。

3 肝臟的病理變化

油紅O染色和HE染色顯示，N組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞無脂肪變性；H組肝組織重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不一的脂滴，呈氣球樣變；A-low組肝組織中度脂肪變性，以小脂滴為主；A-high組和L組肝組織輕度脂肪變性，以細(xì)小脂滴為主，見圖2。

Figure 1.Atherosclerotic plaque lesion in ApoE-/- mice. A: the whole aorta stained with Oil Red O; B: cross-sectional section stained with HE (×50); C: cryostat section of aortic root stained with Oil Red O (×50).

表4 ApoE-/- 小鼠主動脈根部AS斑塊的相對面積

##P<0.01vsN group;*P<0.05vsH group.

4 炎癥因子的mRNA表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示,高脂飲食后，H組主動脈炎癥因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)明顯增加，肝臟PPAR-α的mRNA表達(dá)明顯減少；經(jīng)花色苷提取物治療后，A-low、A-high和L組主動脈炎癥因子IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)明顯減少，肝臟PPAR-α的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，見圖3。

討 論

以往的實驗研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，花色苷及其提取物可以降低心血管疾病和糖尿病等的發(fā)病風(fēng)險，主要歸因于其抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂以及改善內(nèi)皮功能等作用。花色苷類物質(zhì)能降低血清及肝臟中脂肪含量,特別是總膽固醇、低密度脂蛋白水平，花色苷的攝入與AS的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。長期的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，適度的紅酒和果汁提取物等攝入可以降低AS、卒中和外周血管性疾病的發(fā)病率，這與紅酒和果汁提取物中富含花色苷等多種植物化學(xué)物有關(guān)。動物實驗也發(fā)現(xiàn)[4-5]，黑米和紅米花色苷能顯著降低家兔血漿TC和TG水平，延遲動脈粥樣斑塊形成；黑米花色苷提取物、紫薯花色苷和黑果枸杞花色苷均能顯著改善ApoE-/-小鼠的血脂水平，減少斑塊面積，抑制AS斑塊的進(jìn)一步發(fā)展[6-10]。而AS斑塊的進(jìn)行性增大將導(dǎo)致血管壁增厚、血管腔變窄，心臟供血減少，更為嚴(yán)重的是脆性斑塊的破裂能夠直接引起急性冠狀動脈綜合征。最近的研究發(fā)現(xiàn)花色苷單體矢車菊素-3-葡萄糖苷可降低血小板相關(guān)炎癥因子，血漿中CCL5水平的變化與炎癥因子IL-1β的變化呈正相關(guān)[11]，在體外通過抑制CCL5/CCR5介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞遷移而有效抑制炎癥，證明這可能是花色苷減輕炎癥及抗動脈粥樣硬化發(fā)展的機(jī)制之一[12]。

Figure 2. The pathological changes of the liver in the ApoE-/-mice. A: HE staining (×200); B: Oil Red O staining (×400).

Figure 3. The mRNA expression levels of IL-1β, IL-6 and MCP-1 in the aorta, and PPAR-α in the liver of ApoE-/- mice. Mean±SD. n= 3. # P<0.05, ##P<0.01 vs N group; *P<0.05, **P<0.01 vs H group.

本研究發(fā)現(xiàn)高脂飼喂小鼠后，H組小鼠血清的TC和LDL-C水平明顯升高，由于脂質(zhì)水平升高，造成肝臟嚴(yán)重脂肪變性，并促使大量脂質(zhì)進(jìn)入動脈壁，在局部沉積聚集，AS的斑塊面積顯著增加。紫薯花色苷提取液干預(yù)后，A-high組血清TG、TC、LDL-C和AS的斑塊面積及肝脂肪變性程度都顯著降低，血清中TG和TC的下降可能有助于減少斑塊以及脂類物質(zhì)在斑塊上的繼續(xù)堆積；同時LDL-C的降低能減少泡沫細(xì)胞的形成，從而抑制AS的發(fā)展。

AS是多因素共同導(dǎo)致的慢性復(fù)雜炎癥性疾病，多種炎癥介質(zhì)參與AS的發(fā)生發(fā)展[13-15]。炎癥的作用主要依賴于炎癥細(xì)胞的浸潤和促炎因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6和hs-CRP等的產(chǎn)生和釋放，促炎因子對AS的形成和進(jìn)展密切相關(guān)[16]。趨化因子是 AS 斑塊形成及不穩(wěn)定的一個重要介質(zhì)，它不僅能啟動淋巴細(xì)胞浸潤進(jìn)入AS病變，還能通過增加巨噬細(xì)胞的基質(zhì)降解、刺激血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織因子以及誘導(dǎo)斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡等機(jī)制促使斑塊破裂和血栓形成，進(jìn)而在斑塊不穩(wěn)定過程中起重要作用，降低AS斑塊中趨化因子的水平和給予趨化因子受體抗體可有效地減少AS發(fā)展[17-19]。本研究也證實,高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平均顯著增高，紫薯花色苷提取液干預(yù)可明顯降低IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平。紫薯花色苷提取液在一定程度上抑制AS病變的發(fā)展，這可能與降低炎癥反應(yīng)相關(guān)。

PPAR-α的激活可能與脂質(zhì)代謝產(chǎn)物有關(guān)[20-21]。為防止體內(nèi)過多的脂肪堆積，可以通過抑制儲存在脂肪細(xì)胞中的PPAR-α酶調(diào)節(jié)，從而分解脂肪。此外PPARα激活可升高內(nèi)皮細(xì)胞的MCP-1和IL-8的表達(dá)水平[22]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠PPAR-α表達(dá)明顯降低，紫薯花色苷提取液干預(yù)提高了PPAR-α表達(dá)水平。

綜上所述，本研究表明紫薯花色苷提取液能調(diào)節(jié)血脂水平，減少主動脈的斑塊面積，抑制炎癥反應(yīng)，延緩AS 斑塊進(jìn)展。這為防治肝脂肪變性及動脈粥樣硬化提供有效的途徑。