宋 迪， 馬玲玲， 郭志祥， 劉 月， 崔鈺晗， 關(guān)宇鶴， 楊 波， 王 潔

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院河南省免疫與靶向藥物重點實驗室， 醫(yī)學檢驗學院科研創(chuàng)新班， 河南省分子診斷與醫(yī)學檢驗技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

人嗜T淋巴細胞病毒1(human T-lymphotrophic virus 1，HTLV-1)是一種與人類疾病相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，由其感染引發(fā)的成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)和HTLV-1相關(guān)性脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱(HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis，HAM/TSP)目前還沒有有效的治療手段[1]。HTLV-1在人體內(nèi)潛伏期很長，可達20年以上，約有5%的攜帶者可發(fā)展成ATL患者。ATL是一種CD4+T淋巴細胞惡性增殖性腫瘤，急性ATL患者的平均存活期一般不超過 1 年，然而目前對于該病毒如何逃逸宿主的免疫監(jiān)視并引發(fā)疾病的病理機制還所知甚少[2-3]。研究表明，在固有免疫細胞中，Ku70可由HTLV-1感染誘導表達，Ku70可識別HTLV-1的反轉(zhuǎn)中間體并通過激活固有免疫應(yīng)答反應(yīng)來抑制HTLV-1的復制[4]。值得注意的是，HTLV-1主要感染的是T淋巴細胞，而Ku70在T淋巴細胞中的功能并不清楚。本研究通過在HTLV-1陽性的T淋巴細胞系中沉默Ku70的表達，觀察細胞中HTLV-1病毒蛋白表達及干擾素(interferon, IFN)和促炎因子的產(chǎn)生情況。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

Jurkat、MT2、 MT4及C8166細胞均使用RPMI-1640培養(yǎng)液，含10%的胎牛血清、4 mmol/L的L-谷氨酰胺、1×105U/L的青霉素及100 mg/L的鏈霉素，在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中通入5%的CO2懸浮培養(yǎng)。

2 主要試劑

抗β-actin抗體購自Proteintech，貨號為60008-1；抗HTLV-1病毒蛋白Tax抗體購自Santa Cruz Biotechnology，貨號為sc-57872；抗Ku70和抗HTLV-1病毒蛋白p19抗體購自Abcam，貨號分別為ab83501和ab9080；HRP標記的山羊抗兔 II 抗和HRP標記的山羊抗小鼠 II 抗均購自Proteintech，貨號分別為SA00001-2和SA00001-1；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；細胞培養(yǎng)液和胎牛血清均購自Gibco；其它常用生化試劑均為進口分裝。所用引物由金唯智生物科技有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

3 主要方法

3.1RNA干擾 靶向Ku70的siRNA(siRNA-Ku70, SK)購自Invitrogen，正義鏈的序列為5’-GACAUAUCCUUGUUCUACATT-3’，反義鏈的序列為5’-UGUAGAACAAGGAUAUGUCAA-3’； 陰性對照siRNA(siRNA-control, SC)同樣購自Invitrogen，貨號為No. 4390843。SK和SC均采用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染入MT2細胞和MT4細胞中：將5×105的MT2細胞和MT4細胞鋪于無血清無雙抗的Opti-MEM培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染入2 μg的SK和SC，6 h后補充新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，24 h后收獲細胞進行real-time PCR和Western blot檢測。

表1 引物序列

3.2Real-time PCR 細胞中總RNA的抽提使用Invitrogen的TRIzol試劑，并嚴格按照配套的操作手冊進行?；蜣D(zhuǎn)錄本的擴增使用Applied Biosystems的7500 Fast Real-Time PCR System， PCR程序為： 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s, 40個循環(huán)； 72 ℃ 5 min?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法計算。

3.3Western blot實驗 收集細胞后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE,電泳后轉(zhuǎn)膜將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST洗膜1次，用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，用TBST洗膜1次，將稀釋后的I抗與膜室溫雜交2 h或4 ℃過夜。用TBST洗滌3次后將稀釋后的II抗與膜室溫雜交1 h，用TBST洗滌后加入底物顯色，曝光。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結(jié)果用3次獨立實驗的均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用獨立樣品t檢驗比較兩組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HTLV-1陽性T細胞中Ku70表達上升

HTLV-1陽性T細胞系(C8166、MT2及MT4)和HTLV-1陰性T細胞系Jurkat計取相同的細胞數(shù)，裂解后進行Western blot檢測,結(jié)果顯示,與HTLV-1陰性T細胞系Jurkat相比，HTLV-1陽性T細胞系不管是C8166、MT2還是MT4，Ku70蛋白的表達均明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression of Ku70 in HTLV-1 positive T cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs Jurkat.

2 針對Ku70的siRNA可以有效抑制Ku70的表達

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，SK可明顯抑制MT2細胞中Ku70的表達(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of Ku70-specific siRNA on Ku70 expression in MT2 cells. SC: control siRNA; SK: Ku70-specific siRNA. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

3 MT2細胞中基因沉默Ku70后HTLV-1相關(guān)蛋白的表達升高

在MT2細胞中，與對照組(轉(zhuǎn)染SC組)相比，沉默Ku70組(轉(zhuǎn)染SK組)HTLV-1相關(guān)蛋白Tax、p19和Env的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.01)，見圖3、4。

Figure 3.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression at mRNA levels in the MT2 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

4 MT4細胞中基因沉默Ku70后HTLV-1相關(guān)蛋白的表達升高

在MT4細胞中，與對照組(轉(zhuǎn)染SC組)相比，沉默Ku70組(轉(zhuǎn)染SK組)HTLV-1相關(guān)蛋白在mRNA和蛋白水平上的表達均明顯升高(P<0.01)，見圖5、6。

5 MT2細胞中基因沉默Ku70后抗病毒細胞因子表達降低

在MT2細胞中，與對照組(轉(zhuǎn)染SC組)相比，沉默Ku70組(轉(zhuǎn)染SK組)中抗病毒感染細胞因子IFN-α、IFN-γ及TNF-α的量明顯降低(P<0.01)，見圖7。

6 MT4細胞中基因沉默Ku70后抗病毒細胞因子表達降低

在MT4細胞中，與對照組(轉(zhuǎn)染SC組)相比，沉默Ku70組(轉(zhuǎn)染SK組)中抗病毒感染細胞因子IFN-α、IFN-γ及TNF-α的量明顯降低(P<0.01)，見圖8。

Figure 4.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression in the MT2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs SC group.

Figure 5.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression at mRNA levels in the MT4 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs SC group.

Figure 6.The effect of Ku70 knockdown on HTLV-1-related protein expression at protein levels in MT4 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs SC group.

Figure 7.The effect of Ku70 knockdown on anti-viral responses in MT2 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

Figure 8.The effect of Ku70 knockdown on anti-viral responses in the MT4 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SC group.

討 論

1 Ku70在HTLV-1復制中的功能

Ku70在進化上相對保守，在真核生物中普遍存在。Ku70可與Ku80以及催化亞基DNA-PKcs形成復合物DNA-PK，在雙鏈DNA缺口修復中發(fā)揮重要功能[5-6]。值得注意的是，細胞內(nèi)Ku70的表達量比DNA-PKcs高很多[7]，提示Ku70很可能還具有其它的功能。在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染過程中，Ku70的功能存在爭議。有報道稱Ku70可以與HIV-1的整合酶結(jié)合并保護其不受降解，從而有利于HIV-1的復制[8];然而也有研究者發(fā)現(xiàn)Ku復合物抑制HIV-1的轉(zhuǎn)錄表達[9]。而我們之前的研究表明Ku70可識別HTLV-1的反轉(zhuǎn)中間體，通過激活抗病毒固有免疫應(yīng)答反應(yīng)來抑制HTLV-1的復制[4]。這些報道提示我們在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染過程中，Ku70的角色復雜，可能跟病毒類型、細胞類型以及感染階段等多種因素相關(guān)，需要在不同病毒不同細胞中具體研究。

我們首先確認了Ku70在HTLV-1陽性T細胞中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MT2、MT4以及C8166等多種HTLV-1陽性T細胞系中Ku70均有表達，且表達水平高于HTLV-1陰性T細胞系Jurkat,這提示我們Ku70與HTLV-1感染具有一定的相關(guān)性。那么在HTLV-1感染的T細胞中，這種上調(diào)的Ku70的表達究竟具有什么功能呢？據(jù)此本研究采用RNA干擾技術(shù)在HTLV-1陽性T細胞中基因沉默Ku70，研究在HTLV-1陽性T細胞中的功能。為了排除細胞特異性的影響，我們在MT2和MT4這兩種不同的HTLV-1陽性T細胞系中研究了Ku70的功能。利用siRNA沉默Ku70后，我們發(fā)現(xiàn)不管是在MT2還是MT4細胞中，不管是在蛋白水平還是在mRNA水平, HTLV-1病毒蛋白的表達都有明顯提高，提示我們Ku70可能具有抑制HTLV-1病毒復制的功能。

2 Ku70與抗病毒細胞因子的表達

病毒感染宿主細胞后，可激活一系列的抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括干擾素和促炎因子等多種細胞因子的表達，這些細胞因子的表達在適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有重要作用，有利于機體對抗病毒感染，并達到清除病毒的目的[10-11]。關(guān)于Ku70在T細胞中的角色，之前的報道多是從DNA修復的角度研究，那么在HTLV-1陽性T細胞中，Ku70是否有其它作用機制呢？HTLV-1陽性T細胞源自Th細胞，與Th細胞，尤其是Th1細胞具有相似的細胞因子表達譜，如TNF-α以及IFN-γ等[12]。另外，在HTLV-1陽性T細胞中，IFN-α也是表達的[13]。有研究顯示，在固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中，Ku70可以作為DNA識別受體來激活干擾素和促炎因子的表達[14-15]，但是在T細胞中，Ku70對細胞因子的表達是否有調(diào)控作用，目前并不清楚。

據(jù)此本研究關(guān)注了Ku70對HTLV-1陽性T細胞中細胞因子的表達的影響。我們采用RNA干擾技術(shù)在MT2細胞和MT4細胞中沉默Ku70的表達，檢測相關(guān)細胞因子的表達。我們發(fā)現(xiàn)在MT2細胞和MT4細胞中IFN-α和TNF-α均有高表達，而沉默Ku70后，這些細胞因子的表達均有明顯的降低，提示我們Ku70可能具有促進IFN-α和TNF-α等細胞因子表達的功能。值得注意的是，沉默Ku70后，主要由T細胞分泌產(chǎn)生的細胞因子IFN-γ也有明顯降低，而以前并沒有關(guān)于Ku70對IFN-γ表達調(diào)控的報道。在 HTLV-1 陽性 T 細胞中， Ku70 本身是通過什么機制上調(diào)的，又是如何調(diào)控這些細胞因子的表達的，目前還不清楚，值得進一步深入研究。另外，HTLV-1病毒在人體內(nèi)可長期穩(wěn)定存在，說明HTLV-1病毒已建立起一套逃逸免疫監(jiān)視的機制，在HTLV-1陽性T細胞中，病毒如何逃逸Ku70的抗病毒作用，是又一值得關(guān)注的問題。

綜上所述，本研究利用RNA干擾技術(shù)在HTLV-1陽性T細胞中沉默Ku70的表達，揭示沉默Ku70促進了HTLV-1病毒蛋白的表達且抑制了IFN-α、IFN-γ及TNF-α的產(chǎn)生，提示Ku70在HTLV-1陽性T細胞系中可能具有通過促進抗病毒細胞因子表達來調(diào)控HTLV-1復制的功能。