林漢卿，溫貴蘭，汪德生，張升波，徐 麗，李昌紅，文 明，周碧君，程振濤

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.思南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州銅仁 565100)

副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)又名副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)，是雞傳染性鼻炎(Infectiuns coryza,IC)的病原菌，該菌常引起雞發(fā)生顏面腫脹、流鼻涕、呼吸困難和結(jié)膜炎[1]。傳染性鼻炎是一種急性呼吸道傳染病，主要危害育成雞和產(chǎn)蛋雞，可使蛋雞產(chǎn)蛋量下降，肉雞生長受阻、肉質(zhì)下降，發(fā)病率高而病死率低[2]。雞是本病的主要宿主，但也有其他禽類感染該病的病例[3]。該病呈世界性分布，1920年Beach第一次報(bào)道該病，我國從1980年起陸續(xù)有疑似病例出現(xiàn)，馮文達(dá)等[4]于1987年首次在我國分離到副雞嗜血桿菌。副雞嗜血桿菌屬于巴氏桿菌科禽桿菌屬[5]，是一種革蘭陰性球桿菌，兩極著色，無芽胞，無鞭毛，部分致病菌有莢膜[6]。該菌對(duì)生長要求較高，大部分菌株都有NAD(輔酶Ⅰ)依賴性，需要在培養(yǎng)基中添加NAD和血清[7]。Page通過凝集試驗(yàn)法將副雞嗜血桿菌分為A、B、C 3個(gè)血清型，且各型之間不產(chǎn)生交叉保護(hù)[8]，目前我國主要流行的血清型為A型[9]。研究認(rèn)為A型為主要致病血清型，C型菌株也存在不同程度的致病力，而B型是否致病還存在一定爭議[10-12]。本試驗(yàn)從貴州一規(guī)?；岭u養(yǎng)殖場疑似病例中分離到1株細(xì)菌，經(jīng)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)及16 S rRNA序列比對(duì)，鑒定其為C型副雞嗜血桿菌，藥敏試驗(yàn)篩選出了該菌的敏感藥物，致病性試驗(yàn)表明，該分離菌為低致病性菌株。研究結(jié)果可為規(guī)模化養(yǎng)殖場副雞嗜血桿菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來自貴州某規(guī)?；B(yǎng)雞場送檢的疑似患病雞；革蘭染料、藥敏片、生化鑒定管、營養(yǎng)瓊脂，均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，海博生物有限公司產(chǎn)品；NAD，BBI公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；2×EsTaqDNA Polymerase，康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；葡萄球菌菌株,貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株；10日齡小雞,購自貴州大學(xué)農(nóng)場。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 觀察送檢病雞的臨床表現(xiàn)，詢問養(yǎng)殖戶流行情況，并對(duì)病雞進(jìn)行剖檢，觀察檢剖病理變化。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在無菌條件下，用接菌環(huán)從送檢雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟和眶下竇等組織器官取樣，接種于巧克力瓊脂平板上，分別在厭氧與需氧條件下37℃培養(yǎng)24 h后，挑選單個(gè)菌落在含40 μg/mL NAD和50 mL/L胎牛血清的液體培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后選擇明顯變渾濁的液體培養(yǎng)基進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察 吸取50 μL純培養(yǎng)物于巧克力瓊脂平板上，用LB棒涂抹均勻，然后用接菌環(huán)蘸取少量實(shí)驗(yàn)室保存的葡萄球菌在平板上劃一條線，置于37℃培養(yǎng)18 h～20 h，觀察是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.2.4 生化鑒定 用接種環(huán)接種純培養(yǎng)菌液在細(xì)菌生化管內(nèi)，在生化管中加入適量40 μg/mL的NAD和胎牛血清，于37℃培養(yǎng)48 h之后進(jìn)行觀察記錄，生化鑒定結(jié)果判定參照說明書進(jìn)行。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 取100 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂抹于含NAD的巧克力瓊脂平板上，用紙片法將頭孢克洛、青霉素、四環(huán)素、頭孢拉定、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素共10種藥敏片粘貼于平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄所有藥敏片的抑菌圈大小，并根據(jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行敏感性判定。

表1 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 16 S rRNA的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

1.2.6.1 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[13]合成1對(duì)細(xì)菌16 S rRNA通用引物，引物序列為上游引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長度約為1 500 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序合成。

1.2.6.2 細(xì)菌DNA的提取及PCR擴(kuò)增 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取細(xì)菌DNA，用如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：上、下游引物各1 μL，2×EsTaqDNA Polymerase 12.5 μL，DNA 2 μL，H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.2.6.3 16 S rRNA序列分析 用DNA Star7.0軟件將測(cè)得分離菌株的16 S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)副雞嗜血桿菌菌株序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.2.7 動(dòng)物感染試驗(yàn) 將細(xì)菌稀釋于新的含NAD和胎牛血清的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h～20 h，用同樣的培養(yǎng)基進(jìn)行101、102、103、104倍稀釋。用涂片法取原液及每種稀釋度的菌液分別各100 μL，均勻涂抹在巧克力平板上，每種濃度做3個(gè)平行，置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h～18 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將未免疫過傳染性鼻炎的10日齡小雞隨機(jī)分成6組，每組3只。分別取0.1 mL液體培養(yǎng)基、細(xì)菌原液及每種稀釋度的菌液接種于各組小雞的眶下竇，每日觀察小雞發(fā)病情況，并取其內(nèi)臟及鼻竇分泌物進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況及臨床癥狀調(diào)查結(jié)果

該養(yǎng)殖場存欄10 000多只雞，日死亡20只左右，發(fā)病雞可見精神沉郁、部分可見顏面腫脹、流淚、流清亮鼻液、呼吸啰音。觀察送檢雞，可見眼部腫大、流膿液，鼻腔流清亮鼻液，關(guān)節(jié)輕微腫大。剖檢送檢雞，可見肝臟有白色病灶，心包積液，心臟腫大，脾臟腫大且有大理石樣病變(圖1和圖2)。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭染色結(jié)果

經(jīng)37℃厭氧及需氧培養(yǎng)24 h后，從病例所有組織分離到的細(xì)菌在普通瓊脂平板上均不生長。肝臟及眶下竇分離菌在巧克力瓊脂平板上均長出半透明、露珠狀、邊緣整齊的小菌落，將其命名為HPG-GZ-2017，其他組織未分離到。革蘭染色鏡檢結(jié)果顯示，該分離菌為兩極濃染的革蘭陰性短小桿菌。

2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察結(jié)果

培養(yǎng)18 h后，在HPG-GZ-2017與金黃色葡萄球菌同時(shí)存在的巧克力瓊脂平板上，可見靠近葡萄球菌的分離菌菌落較大，而遠(yuǎn)離葡萄球菌的菌落則相對(duì)較小(圖3)。

2.4 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

HPG-GZ-2017硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性；硫化氫、吲哚試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性；過氧化酶試驗(yàn)陰性而氧化酶試驗(yàn)陽性。該菌能發(fā)酵甘露糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不能發(fā)酵半乳糖。

圖1 病雞眼瞼腫大、流膿

圖2 肝臟有白色病灶

圖3 分離株形成的衛(wèi)星現(xiàn)象

2.5 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

HPG-GZ-2017對(duì)頭孢克洛高敏，對(duì)紅霉素中敏，對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、青霉素、諾氟沙星、頭孢拉定低敏，對(duì)復(fù)方新諾明、鏈霉素耐藥(表2)。

2.6 分離菌16 S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，分離株HPG-GZ-2017的16 S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期相符，片段長度約為1 450 bp(圖4)。

2.7 分離菌16 S rRNA序列分析結(jié)果

測(cè)序得到1 437 bp大小序列，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的各亞型標(biāo)準(zhǔn)副雞嗜血桿菌菌株進(jìn)行比對(duì)，核苷酸同源性為93.6%～99.4%。

2.7.1 核苷酸同源性分析結(jié)果 核苷酸同源性分析表明，HPG-GZ-2017與嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CAPM 5113(GenBank：DQ229071)的同源性高達(dá)99.4%，與C型標(biāo)準(zhǔn)菌株HP107(GenBank：GU951544)、CAPM 5111(GenBank：M75056)、Modesto(GenBank：AY498870)的同源性都相對(duì)較高，分別為98.0%、98.2%、98.0%，與A、B型標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性在93.6%～97.3%之間(圖5)。

表2 分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; -.陰性對(duì)照；1～2.分離物

M.DNA Marker DL 2 000; -.Negative control；1-2.Isolates

圖4分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

Fig.4 PCR identification results of isolates

2.7.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示(圖6)，HPG-GZ-2017與C型標(biāo)準(zhǔn)菌株CAPM 5111(GenBank：M75056)處于同一小分支，親緣關(guān)系最近，與A型標(biāo)準(zhǔn)菌株M10071(GenBank：AY613734)、M9919(GenBank：AY613739)以及B型標(biāo)準(zhǔn)菌株M6755(GenBank：AY613719.1)、M10816(GenBank：AY613725)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.8 動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果

將HPG-GZ-2017菌株接種各組10日齡小雞，4 d后各梯度試驗(yàn)組和對(duì)照組雞均食欲正常，精神良好，沒有復(fù)制出IC典型特征癥狀。而各稀釋度菌株接種的巧克力瓊脂平板在24 h后均長出很密集的透明小菌落，根據(jù)計(jì)數(shù)原則全判定為多不可數(shù)。將試驗(yàn)組雞處死并剖檢，其內(nèi)臟均未出現(xiàn)明顯病變，蘸取眶下竇分泌物接種于巧克力平板培養(yǎng)后長成與初分離菌形態(tài)一致的菌落，革蘭染色形態(tài)也與初分離時(shí)的形態(tài)一致。

圖5 分離菌株HPG-GZ-2017株16 S rRNA序列同源性比對(duì)結(jié)果

圖6 分離菌株HPG-GZ-2017 16 S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

本試驗(yàn)的病料來源于貴州省某規(guī)?；B(yǎng)殖場，病雞有眼瞼腫大、流鼻液及呼吸困難等癥狀，與傳染性鼻炎典型癥狀相符。剖檢可見心包積液，這可能與A、C菌株分離的多糖有關(guān)[14]。另外，本試驗(yàn)同時(shí)從病雞體內(nèi)檢測(cè)到了禽白血病病毒病原核酸，這很可能是引起病雞肝臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)的原因。

該分離菌在未加NAD的血平板上不生長，在同樣未加NAD的巧克力平板上生長良好。這是因?yàn)榍煽肆ζ桨逯谱鬟^程中紅細(xì)胞會(huì)破裂，進(jìn)而釋放出有利于該菌生長的Ⅴ因子(NADH)。在該菌與產(chǎn)NAD的葡萄球菌交叉劃線的巧克力平板上可見明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象，這些現(xiàn)象表明，該分離菌株具有NAD依賴性，這是鑒別該菌的重要依據(jù)[15-16]。細(xì)菌菌落為邊緣整齊的半透明小菌落，革蘭染色可見該菌為紅色的兩極濃染的短小桿菌，都符合副雞嗜血桿菌的特性。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，HPG-GZ-2017不能發(fā)酵半乳糖，且不含過氧化氫酶，說明該菌為副雞嗜血桿菌，而非其他禽桿菌[16]。由以上結(jié)果基本可判定該分離菌為副雞嗜血桿菌，將其命名為HPG-GZ-2017。序列分析結(jié)果表明，HPG-GZ-2017與嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CAPM 5113(GenBank：DQ229071)的同源性高達(dá)99.4%，由此可確定該菌株為嗜血桿菌。該菌與C型標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性比與A、B兩型標(biāo)準(zhǔn)菌株都高，且與C型菌株的親緣關(guān)系最近，因此確定該菌株為C型嗜血桿菌。

將HPG-GZ-2017接種于未免疫傳染性鼻炎疫苗的10日齡小雞，4 d后可從小雞體內(nèi)分離到該細(xì)菌，但小雞不發(fā)生明顯病變，而貴州省某規(guī)?；B(yǎng)殖場的雞可見明顯的傳染性鼻炎典型癥狀，這可能受多種原因的影響。雖然各個(gè)年齡段的雞都可感染副雞嗜血桿菌，但成年雞的易感性遠(yuǎn)大于雛雞[17]，試驗(yàn)雞日齡過小可能是未能復(fù)制出IC特征癥狀的其中一個(gè)原因。另外，雞場的飼養(yǎng)環(huán)境、感染劑量和感染方式等也可能是影響動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果的原因。為探明危害雞場雞的主要病原，我們對(duì)雞場送檢雞進(jìn)行了一些常見的禽類病毒的病原核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病雞體內(nèi)含有高濃度的J亞型禽白血病病毒。禽白血病是一種免疫抑制病，可降低雞的抵抗力，繼發(fā)其他病原的感染。雞場送檢雞患有禽白血病很可能是其出現(xiàn)典型IC癥狀的重要原因。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，HPG-GZ-2017對(duì)頭孢克洛高度敏感，對(duì)大多數(shù)藥物低敏或耐藥，這與雞場濫用抗菌藥物有很大關(guān)系。防治傳染性鼻炎，不僅要注重飼養(yǎng)管理、嚴(yán)格執(zhí)行疫苗防疫，還應(yīng)注意預(yù)防禽白血病、馬立克病等免疫抑制性疾病的感染。