姜清漪，呂占軍

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

環(huán)境突變或長期處于不適宜的環(huán)境，雞易受應激因素的不良影響。運輸應激使雞遭受多種應激原，包括人為因素(捕捉、限飼等)、環(huán)境變化(顛簸、高溫、高密度等)及社群壓力等[1-3]。研究表明，應激因素會引起一氧化氮(nitric oxide,NO)過量產(chǎn)生損傷血管屏障導致組織水腫，產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)進而刺激誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性增加[4]。NO和NOS參與卵巢性腺激素的分泌[5]，現(xiàn)已證實過量的NO能夠抑制性腺類固醇激素的合成[6]。

近年來，運輸應激越來越受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注，但大多研究運輸應激對大型家畜或?qū)θ馇萑赓|(zhì)及死亡率，以及對蛋禽卵巢功能影響的研究相對較少。本試驗主要針對運輸應激對蛋雞卵巢iNOS活性、NO含量及性激素受體mRNA表達的研究，旨在了解運輸應激對蛋雞卵巢組織及產(chǎn)蛋性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 健康海蘭褐蛋雞40只，32周齡，體重約1.853 kg，哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 iNOS測定試劑盒、NO測定試劑盒和考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)定量測試盒，購自南京建成生物工程研究所；雌二醇受體(estradiol receptor,E2R)引物、孕酮受體(progesterone receptor,PR)引物、AR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(引物信息詳見表1)；總RNA提取試劑,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京金式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；熒光染料，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和試驗處理 40只海蘭褐蛋雞隨機分為對照組和試驗組，每組20只。試驗雞均飼喂于同一雞舍，飼養(yǎng)管理條件相同(白天為自然光照，晚上輔以人工光照)，自由采食和飲水，適應期為1周。運輸途中停止飼喂食物和水。試驗組采用家禽運輸車在公路(包括紅綠燈路口和顛簸路段)上以60 km/h的車速進行6 h的道路運輸。返回雞舍后，從對照組和試驗組隨機選取6只雞處死，分別采集兩組雞卵巢組織凍存于-80℃冰箱中，之后進行iNOS活性、NO含量及性激素受體mRNA表達的測定。

1.2.2 樣品采集和指標檢測 從-80℃冰箱中取0.5 g卵巢組織，加9倍的生理鹽水制備成10%的組織勻漿，低溫離心(3 000 r/min，10 min)后，取50 μL上清液參照各檢測試劑盒說明書采用分光光度法測定iNOS活性和NO含量；按照詳細的試驗步驟，從-80℃冰箱中取0.1 g組織進行RNA的提純、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應，結(jié)果用2-△△CT法表示各激素受體mRNA表達量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用GraphPad Prism 5.0作圖軟件進行繪圖，試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行處理，檢驗結(jié)果用平均值±標準差表示，組間差異比較采用One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01、P<0.001為差異極顯著。

表1 E2R、PR、AR和β-actin基因引物信息

2 結(jié)果

2.1 運輸應激對蛋雞卵巢iNOS活性和NO含量的影響

運輸應激對蛋雞卵巢iNOS活性和NO含量的影響見表2、圖1和圖2。由圖1可知，運輸應激6 h后，與對照組相比，試驗組的iNOS活性極顯著增加(P<0.01)。由圖2可知，運輸應激6 h后，與對照組相比，試驗組的NO含量極顯著升高(P<0.01)。

表2 卵巢蛋白濃度、iNOS活性和NO含量

**表示差異極顯著(P<0.001)

** shows extremely significant difference (P<0.001)

圖1卵巢iNOS活性

Fig.1 iNOS activity in ovaries

通過以上結(jié)果可以說明，運輸應激可以使蛋雞卵巢iNOS活性增加，NO含量升高。

**表示差異極顯著(P<0.001)

** shows extremely significant difference (P<0.001)

圖2卵巢NO含量

Fig.2 NO content in ovaries

2.2 運輸應激對蛋雞卵巢性激素受體基因表達的影響

運輸應激對蛋雞卵巢性激素受體mRNA表達的影響見表3和圖3。運輸應激6 h后，與對照組相比，試驗組E2R mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.001)，試驗組PR mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.001)，試驗組AR mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.001)。

通過以上結(jié)果可以說明，運輸應激可以使蛋雞卵巢E2R、PR mRNA相對表達量降低；使AR mRNA相對表達量升高。

表3 卵巢E2R、PR和AR mRNA相對表達量

***表示差異極顯著(P<0.001)

*** shows extremely significant difference (P<0.001)

圖3卵巢性激素受體mRNA相對表達量

Fig.3 Relative mRNA expression of ovarian gonadal
hormone receptors

3 討論

有報道表明，發(fā)生應激反應時雞群慌恐欲逃，驚慌過度的雞高聲鳴叫，嚴重時表現(xiàn)精神呆滯甚至死亡[7-8]。本試驗在對蛋雞進行運輸應激后，觀察到警覺，躁動不安，鳴叫，羽毛雜亂豎立，張口呼吸且頻率加快等表現(xiàn)。對應激組的雞進行剖檢，觀察到除心肌輕微充血外，其他臟器無明顯特征性病變。這些表現(xiàn)與上面的報道存在相似性，同時也與胡丹等[9]、楊正等[10]觀察結(jié)果基本一致。

強烈持久的應激作用導致的全身或局部炎癥反應，可作為宿主防御和機體器官功能障礙的重要指標[11]。NO由左旋精氨酸在NOS催化下合成，與機體的許多生理或病理過程密切相關(guān)。NOS包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS或bNOS)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和iNOS，其中只有iNOS能夠催化產(chǎn)生大量NO且這個過程僅在炎癥反應中表達[12-13]。NO通過下丘腦促性腺激素釋放激素直接作用于卵巢脈管系統(tǒng)調(diào)控生殖活動[14]。大量研究表明，正常生理狀態(tài)下，適量NO和NOS可作為促生長劑對雌性動物卵泡發(fā)育、卵巢類固醇激素合成等是必要且有利的，當外界應激因素影響機體出現(xiàn)非穩(wěn)態(tài)時NO則會大量迅速合成，有研究者認為過量NO對性腺類固醇合成有消極作用[15-19]。但是NO對于卵巢雌激素和孕酮分泌的抑制機制尚未完全清楚，一般認為，NO對雌二醇的抑制效應可能是因為NO抑制了與雌二醇生成有關(guān)的細胞色素P450芳香化酶活性，繼而使用來合成雌二醇前體的雄烯二酮作用受到抑制，致使雄烯二酮，尤其是睪酮堆積過量[6]。

本試驗表明，運輸應激組蛋雞卵巢iNOS活性增加、NO含量升高，E2R和PR 相對mRNA表達量降低、AR mRNA相對表達量升高，這說明運輸應激可能引起卵巢組織發(fā)生炎癥反應，引起卵巢組織損傷，產(chǎn)生過量NO，抑制與卵泡發(fā)育、排卵等生殖活動相關(guān)的雌二醇和孕酮的合成，而AR mRNA相對表達量的升高預示著卵巢可能發(fā)生疾病。NO/iNOS與性激素關(guān)系以及性激素間調(diào)控的具體機制還有待進一步深入研究。