金家瑞 ，郭美仙，張冰清，劉光明，彭 芳，劉曉波

(大理大學藥學與化學學院/云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000)

惡性腫瘤目前已成為繼心血管系統(tǒng)疾病之后嚴重危害人類生命健康的第二號“殺手”。目前，化療是治療惡性腫瘤的主要方法之一，雖然化療藥物對腫瘤細胞有較好的殺滅作用，但是化療藥物在殺滅腫瘤細胞時，也損傷了機體的正常細胞，引起嚴重的毒副反應，甚至患者被迫中斷治療，導致治療失敗。因此，如何減輕由化療藥物對腫瘤患者造成的嚴重不良反應，成為了臨床急切需要解決的重大問題[1]。近年來的研究表明[2-5]，中藥聯(lián)合化療藥物治療腫瘤時具有協(xié)同抑制腫瘤生長，改善機體的內環(huán)境，增強腫瘤患者的免疫力，減輕毒副反應，改善腫瘤患者的生存周期和生存質量，可起到增效減毒的作用。如參芪扶正注射液、康艾注射液、復方苦參注射液等。因此，從中藥中尋找對化療藥物有增效減毒作用的活性成分，已成為當前抗腫瘤藥物研究的熱點。美洲大蠊(Periplanetaamericana)具有補氣養(yǎng)陰、理氣散結、解毒生肌的功效，本課題組采用現(xiàn)代提取分離技術得到了美洲大蠊中的小分子多肽CⅡ-3[6-7]。前期研究表明，CⅡ-3可以增加外周血中白細胞的數(shù)量、增強淋巴細胞轉化增殖功能及自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)的殺傷活性，從而改善免疫力低下小鼠的免疫功能[8-9]，同時CⅡ-3對肝癌、肺癌和胃癌還具有一定的抗腫瘤作用，其抑瘤率可達61.69 %[10-11]。鑒于中藥在腫瘤化療中有良好的增效減毒作用，以及CⅡ-3有改善免疫力和抗腫瘤的作用。因此，本課題組對CⅡ-3在化療中的增效減毒作用進行探索性研究。本試驗在前期研究的基礎上，從聯(lián)合化療藥物治療腫瘤的角度出發(fā)，以抑瘤率、臟器指數(shù)、外周血細胞數(shù)量、血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)的含量及肝臟組織中谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)和谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)的活性等指標來評價CⅡ-3在腫瘤化療中的增效減毒作用，為CⅡ-3在此領域的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Balb/c小鼠(SPF級，雌雄各半，18 g～22 g)，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證編號：SYXK(滇)2011—0004。

1.1.2 藥品和試劑 CⅡ-3，大理大學何正春副教授提供；注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)，山西普德藥業(yè)股份有限公司產品；氯化鈉注射液，貴州天地藥業(yè)有限責任公司產品；參芪扶正注射液，麗珠集團利民制藥廠產品。

IgA檢測試劑盒、AST試劑盒、ALT試劑盒，南京建成生物工程研究所產品；TNF-α試劑盒、IL-2試劑盒，上海滬峰生物科技有限公司產品。

1.1.3 儀器設備 CO2培養(yǎng)箱(5510E型)，美國NUAIRE公司產品；酶標分析儀(Gen5型酶標分析儀)；倒置顯微鏡(CKX41/CKX31型)，奧林巴斯(中國)有限公司產品；SCANSPEED高速低溫離心機(1580MGR型)，丹麥LABOGENE公司產品；全自動動物血液細胞分析儀(XFA6130型)，南京普朗醫(yī)療設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 H22荷瘤模型的分組和給藥 取60只Balb/c小鼠(雌雄各半)用無菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為22℃～25 ℃，濕度為50%～80%。適應環(huán)境飼養(yǎng)3 d后，隨機分為6組，每組10只。即1組為H22模型組；2組為CTX組，3、4、5組分別為CⅡ-3高、中、低劑量與CTX聯(lián)合用藥組；6組為參芪扶正注射液聯(lián)合CTX組；其中CⅡ-3灌胃給藥高、中、低劑量分別為0.1、0.05、0.025 g/kg[8]，給藥容量為0.02 mL/g，CTX腹腔注射給藥0.02 g/kg，陽性藥參芪扶正注射液腹腔注射給藥1.25 g/kg，模型組給予相同容量的生理鹽水。造模24 h后開始給藥，每天首先灌胃給予CⅡ-3，30 min后腹腔注射CTX，隔日稱重，連續(xù)給藥15 d[12]。

1.2.2 CⅡ-3聯(lián)合 CTX 對H22荷瘤小鼠的增效作用研究

1.2.2.1 瘤塊質量與抑瘤率的檢測 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剝離瘤塊，稱重，計算腫瘤生長的抑制率[13]。計算公式如下：

腫瘤生長抑制率=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.2.2 骨髓有核細胞計數(shù) 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，將其右側股骨剝離，用生理鹽水反復沖洗骨髓腔，在顯微鏡下進行骨髓有核細胞的計數(shù)[14]。

1.2.2.3 臟器重量和臟器指數(shù)的測定 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死動物，稱取體重，剝取臟器并稱重，計算臟器指數(shù)[13]。

1.2.2.4 外周血細胞測定 末次給藥24 h后，眼眶后靜脈叢采血20 μL，用全自動血球計數(shù)儀測定外周血細胞數(shù)量[13]。

1.2.2.5 小鼠血清中TNF-α、IL-2含量的測定 末次給藥24 h后，分離小鼠血清，按試劑盒說明書操作，采用酶標儀以ELISA檢測，并根據(jù)標準曲線方程分別計算樣品中TNF-α、IL-2的濃度[15]。

1.2.2.6 小鼠血清中IgA含量的測定 末次給藥24 h后，分離小鼠血清，按試劑盒說明書操作，計算多點定標曲線處理，以測定管△A求得IgA含量。

1.2.2.7 小鼠肝臟組織中AST、ALT活力的測定 末次給藥 24 h后，取小鼠血分離血清檢測ALT、AST，用酶標儀測定各孔OD值，絕對OD值=測定孔OD值-對照孔OD值，查標準曲線可得相應的AST/ALT活力。

2 結果

2.1 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響

由表1和圖1可以看出，與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠的瘤塊重量顯著低于模型組(P<0.01)，與單獨使用CTX組比較CTX聯(lián)合CⅡ-3高、中劑量組與CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組的瘤塊質量均顯著降低(P<0.05，P< 0.01)，說明CⅡ-3聯(lián)合CTX提高H22荷瘤小鼠的抑瘤率，與CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組比較，CTX聯(lián)合CⅡ-3高劑量組抑瘤率優(yōu)于CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組。

表1 H22荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率

注：與模型組比較，bP<0.01；與CTX組比較，cP<0.05，dP<0.01。

Note：Compared with the model group，bP<0.01；Compared with CTX group，cP<0.05,dP<0.01.

圖1 H22荷瘤小鼠瘤塊質量

2.2 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠骨髓有核細胞的影響

由表2可以看出，與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠的骨髓有核細胞數(shù)量顯著低于模型組(P<0.05)，與單獨使用CTX組比較，CTX聯(lián)合CⅡ-3高、中、低劑量組和CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組的骨髓有核細胞數(shù)量均顯著升高(P<0.01)，提示CⅡ-3對由CTX造成的造血系統(tǒng)損傷有明顯改善作用。

表2 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠骨髓有核細胞的影響

注：與模型組比較，bP<0.01；與CTX組比較，dP<0.01。

Note：Compared with the model group，bP<0.01；Compared with CTX group，dP<0.01.

2.3 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

由表3可以看出，與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)均顯著低于模型組(P<0.01)，與單獨使用CTX組比較，CTX聯(lián)合CⅡ-3高、中、低劑量組與CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，提示CⅡ-3可以改善由于CTX導致的臟器損傷，可以降低CTX的毒性作用。

2.4 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠血細胞數(shù)量的影響

由表4可以看出，與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠的白細胞、紅細胞以及血小板數(shù)量均顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01)，與單獨使用CTX組比較，CTX聯(lián)合CⅡ-3高、中、低劑量組與CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組的白細胞、紅細胞以及血小板數(shù)量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，提示CⅡ-3可以改善由CTX導致的外周血中血細胞數(shù)量的降低，增強免疫力。

2.5 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2、IgA含量的影響

由表5可以看出，與模型組比較，CTX組荷瘤小鼠的TNF-α和IL-2的含量顯著高于模型組(P<0.05，P<0.01)，IgA的含量顯著低于模型組(P<0.01)，與單獨使用CTX組比較，CTX聯(lián)合CⅡ-3高、中、低劑量組聯(lián)合用藥后TNF-α、IL-2和IgA的含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，提示CⅡ-3可以增強CTX的抗腫瘤作用，同時提高機體免疫力。

2.6 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠肝臟ALT、AST活力的影響

由表6可以看出，各組小鼠之間肝臟ALT、AST活力并無顯著性差異(P>0.05)，提示CⅡ-3對H22荷瘤小鼠肝臟ALT、AST活力并無影響。

表3 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

注：與模型組比較，bP<0.01；與CTX組比較，cP<0.05，dP<0.01。

Note：Compared with the model group，bP<0.01；Compared with CTX group，cP<0.05,dP<0.01.

表4 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠血細胞數(shù)量的影響

注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01；與CTX組比較，cP<0.05，dP<0.01。

Note：Compared with the model group，aP<0.05，bP<0.01；Compared with CTX group，cP<0.05,dP<0.01.

表5 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2、IgA含量的影響

注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01；與CTX組比較，cP<0.05，dP<0.01。

Note：Compared with the model group，aP<0.05，bP<0.01；Compared with CTX group，cP<0.05,dP<0.01.

表6 CⅡ-3對H22荷瘤小鼠肝臟ALT、AST活力的影響

3 討論

化療作為目前臨床上治療惡性腫瘤的常規(guī)手段，其療效確切，但是化療藥物在殺傷腫瘤細胞時，也對機體產生了嚴重的毒性，且多次使用后腫瘤細胞也會對其產生耐藥性[16]，致使治療失敗。如順鉑、CTX對腫瘤細胞缺乏特異性，常常引起免疫功能抑制、骨髓抑制、外周血白細胞和血小板減少，以及肝腎臟器損害等毒副作用[17]，這已經(jīng)成為了限制CTX發(fā)揮治療效果的最大阻礙之一。研究表明[18-19]，腫瘤化療配合中醫(yī)中藥辯證治療，能減輕化療藥物的毒副反應，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，改善腫瘤患者的生存周期和生存質量。目前，在臨床上已使用和處于臨床試驗階段的增效減毒藥物，如參芪扶正注射液、金復康口服液、騰龍補中湯等[20]，可見中藥聯(lián)合化療藥治療腫瘤，已成為抗腫瘤藥物研究的熱點。

參芪扶正注射液是由黨參、黃芪提取的純中藥注射劑，能補中益氣、健脾益肺，同時增強機體免疫力，對于腫瘤患者能減輕化療對骨髓造血功能的抑制，并促進骨髓造血功能的恢復，提高細胞免疫功能，改善患者的生活質量，作為化療輔佐用藥在臨床上得到了一定的推廣[21-22]。因此，本研究選用參芪扶正注射液作為陽性對照藥。研究數(shù)據(jù)表明，CTX聯(lián)合CⅡ-3高劑量組對H22荷瘤小鼠的抑瘤率可高達57.90%，其抑瘤效果優(yōu)于單獨使用CTX和CTX聯(lián)合參芪扶正注射液組。與CTX組比較，聯(lián)合給藥后H22荷瘤小鼠的各臟器指數(shù)、外周血細胞數(shù)量、骨髓有核細胞數(shù)量均有不同程度的提高，可以提高血清中TNF-α、IgA和IL-2的含量(P<0.05，P<0.01)，這表明CⅡ-3在增強CTX抗腫瘤作用的同時，還可以降低CTX對機體的毒副作用，改善機體的免疫功能和造血系統(tǒng)功能。與聯(lián)合參芪扶正注射液組比較，CⅡ-3聯(lián)合高劑量組在增效減毒作用與提高免疫方面的作用接近聯(lián)合參芪扶正注射液組，為美洲大蠊抗腫瘤活性組分CⅡ-3在腫瘤化療中作為輔助用藥提供了試驗依據(jù)。

綜上所述，CⅡ-3聯(lián)合CTX可增強抗腫瘤的作用，同時降低了對CTX所致的骨髓、免疫器官及肝臟的損傷，從而起到增效減毒的作用，同時為美洲大蠊抗腫瘤活性組分CⅡ-3在腫瘤化療中作為輔助應用提供依據(jù)。CⅡ-3在聯(lián)合化療藥物治療腫瘤中確有明顯的增效減毒作用，但機制尚未明確，因此，將在后期著重對CⅡ-3增效減毒的作用機制進行探討。