閆 斌，馬 鐸，于躍利，韓麗紅*

(1.莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 福建省莆田 351100;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外二科,內(nèi)蒙古包頭 014010)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最常見女性惡性腫瘤之一，是女性癌癥患者死亡的主要原因，女性癌癥患者的死亡率為14%[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、蛋白合成、新陳代謝、轉(zhuǎn)化和血管生成等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。mTOR信號(hào)通路的異常激活和許多類型的惡性腫瘤密切相關(guān)，在甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制已有相關(guān)報(bào)道。mTOR及其上下游分子成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)和主要預(yù)后指標(biāo)的研究仍在進(jìn)行中，進(jìn)一步探討該信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制與其他信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)，有助于人們針對(duì)mTOR信號(hào)途徑來(lái)尋找新的抗腫瘤藥物[4]。本試驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了2015年3月至2017年8月在包頭市腫瘤醫(yī)院就治的60例乳腺癌患者的乳腺癌組織及40例癌旁組織p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表達(dá)情況，為乳腺癌的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 選自2015年3月至2017年8月于包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)根治切除的乳腺癌石蠟標(biāo)本60例及癌旁組織(腫瘤邊緣5 cm處)石蠟標(biāo)本40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)活檢證實(shí)為乳腺癌，根治性手術(shù)治療后留有石蠟包埋的組織標(biāo)本，所有標(biāo)本術(shù)前未接受化療、放療或內(nèi)分泌治療，無(wú)合并其他惡性腫瘤和遺傳病史，且具備完整臨床治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：男性乳腺癌，接受化療、放療、內(nèi)分泌治療。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)納入60例女性乳腺癌患者，其中年齡≥45歲27例，<45歲33例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例；乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期17例。

1.1.2 試劑 p-mTOR(Ser2448)一抗、P-4EBP1(Ser64)、P-S6K1(Thr389)一抗，江蘇厚普生物科技有限公司產(chǎn)品；抗體來(lái)源為兔，多克隆抗體，適用于人；HRP標(biāo)記抗兔二抗，購(gòu)于福州邁新生物公司(KIT5006)；DAB顯色液，購(gòu)于江蘇厚普生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 操作流程 (1)溫?。簩⑶衅胖糜?2℃溫浴箱內(nèi)2 h。(2)切片脫蠟水化：將切片放置于二甲苯溶液中，每次15 min，共3次,使切片完全脫蠟，在梯度酒精中各浸泡5 min完全水化。(3)沖洗：用PBS沖洗脫蠟和水化后的切片3次，每次2 min，再用蒸餾水沖洗5 min。(4)修復(fù)抗原：檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)，高壓加熱2.5 min，取出切片冷卻至室溫。(5)洗片：PBS洗片3次，每次2 min。(6)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性阻斷：將組織切片用30 mL/L H2O2室溫孵育10 min。(7)洗片：PBS洗片3次，每次2 min。(8)一抗孵育：將沖洗完的切片擦拭后，加上一抗(p-mTOR稀釋度1∶100；p-4EBP1稀釋度1∶100；p-S6K1稀釋度1∶50)4℃孵育過(guò)夜，次日37℃復(fù)溫60 min,PBS洗片3次，每次2 min。(9)二抗孵育：加二抗后，將濕盒置于37℃溫箱20 min，PBS洗片3次，每次2 min。(10)顯色：向切片滴加新配制的DAB顯示液2滴，置于顯微鏡下觀察組織切片5 min～10 min，調(diào)整著色，適時(shí)滴加蒸餾水終止顯色。(11)脫水?dāng)z片：梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固后置于顯微觀察并進(jìn)行攝片。

1.2.2 染色結(jié)果的判斷 通過(guò)特異性抗原抗體反應(yīng)，使細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，以0.01 mol/L PBS替代一抗作為陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用雙盲法閱片，染色結(jié)果由2名病理科副主任醫(yī)師分別獨(dú)自判讀,對(duì)于不一致的判讀結(jié)果經(jīng)商討后得出一致結(jié)論。參照文獻(xiàn)[5]的標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0為(-)，0～20%為(±)，21%～80%為(+)，>80%為(++)；(-)和(±)為陰性，(+)和(++)為陽(yáng)性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0軟件，組間陽(yáng)性率比較采用四格表2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法檢驗(yàn)，組間陽(yáng)性率相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

在本次試驗(yàn)的60例乳腺癌組織和40例癌旁組織中，p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1主要表達(dá)于乳腺組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色(圖1、圖2及圖3)。最后得出p-mTOR在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為43例，陽(yáng)性率為71.7%(43/60)，癌旁組織中p-mTOR陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為17例，陽(yáng)性率為42.5%(17/40)，乳腺癌組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p-4EBP1在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為16例，陽(yáng)性率為26.7%(16/60)，癌旁組織中p-4EBP1陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為4例，陽(yáng)性率為10.0%(4/40),乳腺癌組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p-S6K1在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為27例，陽(yáng)性率為45.0%(27/60)，癌旁組織中p-S6K1陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)為例，陽(yáng)性率為12.5%(5/40)，乳腺癌組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌中的表達(dá)情況

A.p-mTOR在癌旁組織中的表達(dá)主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)中(20×10)；B.p-mTOR在乳腺癌組織中的表達(dá)主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)中(20×10)

A.Expression of p-mTOR in paracancerous tissues is mainly in the cytoplasm of breast tissues(20×10); B.Expression of p-mTOR in breast cancer tissues is mainly in the cytoplasm of breast tissues(20×10)

圖1 p-mTOR在癌旁組織及乳腺癌組織中的表達(dá)
Fig.1 Expression of p-mTOR in paracancerous tissues and breast cancer tissues

A.p-4EBP1在癌旁組織中的表達(dá)主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 (20×10); B.p-4EBP1在乳腺癌組織中的表達(dá)主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(20×10)

A.Expression of p-4EBP1 in paracancerous tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissues(20×10); B.Expression of p-4EBP1 in breast cancer tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10)

圖2 p-4EBP1在癌旁組織及乳腺癌組織中的表達(dá)
Fig.2 Expression of p-4EBP1 in paracancerous tissues and breast cancer tissues

A.p-S6K1在癌旁組織中的表達(dá)主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 (20×10); B.p-S6K1在乳腺癌組織中的表達(dá)主要在乳腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(20×10)

A.Expression of p-S6K1 in paracancerous tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10); B.Expression of p-S6K1 in breast cancer tissues is mainly in cytoplasm and nucleus of breast tissue(20×10)

圖3 p-S6K1在癌旁組織及乳腺癌組織中的表達(dá)
Fig.3 Expression of p-S6K1 in paracancerous tissues and breast cancer tissues

3 討論

乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多級(jí)別、多步驟的過(guò)程，它涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活，導(dǎo)致了相關(guān)蛋白合成障礙，最終改變細(xì)胞生物學(xué)行為，從而導(dǎo)致了腫瘤的生成。而m-TOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要信號(hào)通路，它的異常激活與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系[5]。而且mTOR信號(hào)通路的紊亂影響許多非惡性腫瘤疾病的病理生理，如心血管，神經(jīng)退行性疾病和各種各樣的腎臟疾病。mTOR的活性受多種調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白的影響，主要包括3條信號(hào)通路調(diào)節(jié)，分別是PI3K/AMPK/mTOR、LKB1/AMPk/mTOR和氨基酸通路。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種進(jìn)化上十分保守的蛋白激酶，通過(guò)整合生長(zhǎng)因子，氨基酸和能量等環(huán)境信號(hào)發(fā)揮著重要的作用[6]。mTOR在生物體內(nèi)以mTORC1和mTORC2兩種形式存在，mTORC1控制蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞代謝反應(yīng)，mTORC2調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生存期。mTOR激活后，可磷酸化其下游分子4EBP1和S6K1，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、遷移及腫瘤血管的生成。因此，mTOR途徑的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，也可以刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。4EBP1和S6K1是目前研究最廣泛的mTOR的底物。

根據(jù)基因表達(dá)譜和分子生物學(xué)標(biāo)記物的表達(dá)情況，可以將乳腺癌分為4種亞型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2過(guò)表達(dá)型和三陰性乳腺癌[7]。信號(hào)通路的異常激活在不同亞型乳腺癌中存在差異。王杰等[8]采用組織芯片技術(shù)和免疫組化染色方法,檢測(cè)p-mTOR在75例Luminal A型乳腺癌患者和136例Luminal B型乳腺癌患者中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。得出p-mTOR在乳腺癌不同亞型患者中的多樣化表達(dá)特點(diǎn)提示不同的疾病行為及預(yù)后意義。p-mTOR作為L(zhǎng)uminal B型乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素,是潛在的有效靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示p-mTOR在觀察組和對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為71.7%和42.5%，p-4EBP1在觀察組和對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為26.7%和10.0%，p-S6K1在觀察組和對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為45.0%和12.5%。p-mTOR、p-mTOR及p-S6K1 在胃癌組織當(dāng)中相應(yīng)表達(dá)水平高于癌旁組織，差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果顯示mTOR、4EBP1和S6K1在乳腺癌組織中高表達(dá)，提示mTOR、4EBP1和S6K1可能與乳腺癌的發(fā)生有密切關(guān)系，為mTOR、4EBP1和S6K1是否能作為乳腺癌的標(biāo)記物提供更多的證據(jù)。已有研究發(fā)現(xiàn)mTOR磷酸化水平從正常的乳腺組織到不典型增生的乳腺組織，再到惡性轉(zhuǎn)化的組織，以致到腫瘤浸潤(rùn)的組織中逐漸增加。

已報(bào)道m(xù)TOR信號(hào)通路異常存在于胃癌、肺癌等惡性腫瘤中[9]。一些機(jī)制仍然沒有闡明清楚，例如mTOR如何協(xié)同其他信號(hào)通路和蛋白質(zhì)調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和入侵；mTOR是如何調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附/去黏附功能的。顯然，需要更多的研究來(lái)闡明這些機(jī)制，增加對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移理解，并為新的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供更多的證據(jù)[10]。

綜上所述，mTOR及其下游信號(hào)分子4EBP1和S6K1在乳腺癌中的表達(dá)升高與乳腺癌的發(fā)展有關(guān)，可通過(guò)進(jìn)一步研究乳腺癌中mTOR及其下游信號(hào)分子4EBP1和S6K1與病理分期、生存期的研究，對(duì)于臨床上對(duì)乳腺癌的診斷和治療有一定的指導(dǎo)意義。