范 馨 ，石穎欣 ，屠寶英，董 馨

（1.廣東華潤(rùn)順?lè)逅帢I(yè)有限公司，廣東 深圳 518110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

阿奇霉素糖漿是臨床上應(yīng)用較為廣泛的新一代大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素之一[1-3]。該藥主要用于治療急性咽炎、急性扁桃體炎、鼻竇炎、中耳炎、急性支氣管炎等疾病。在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-135)-2003Z中，檢測(cè)阿奇霉素含量的方法為抗生素微生物檢定法。有研究表明，該方法的操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且檢測(cè)的結(jié)果較不穩(wěn)定[4-5]。在USP26版《美國(guó)藥典》和416版《歐洲藥典》中，檢測(cè)阿奇霉素含量的方法均為高效液相色譜法[6]。本文主要探討用高效液相色譜法測(cè)定阿奇霉素糖漿中阿奇霉素含量的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

本次實(shí)驗(yàn)所用的儀器為Agilent 1100型高效液相色譜儀、Dionex U3000型高效液相色譜儀、Starious十萬(wàn)分之一天平（生產(chǎn)企業(yè)為賽多利斯科學(xué)儀器公司，型號(hào)為CPA225D）、超純水機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)為廣州東銳科技有限公司，型號(hào)為SIMPLICITY185）和超聲波清洗機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)為上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號(hào)為BX3200H）。

1.2 試劑

本次實(shí)驗(yàn)所用的試劑為阿奇霉素對(duì)照品（生產(chǎn)企業(yè)為中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130593-201303）、阿奇霉素糖漿（生產(chǎn)企業(yè)為廣東華潤(rùn)順?lè)逅帢I(yè)有限公司，批號(hào)為 20170301、20170302、20170303，規(guī)格為 50 ml:1.0 g）、色譜純甲醇（生產(chǎn)企業(yè)為德國(guó)MERCK，批號(hào)為I847607636）、色譜純乙腈（生產(chǎn)企業(yè)為德國(guó)MERCK，批號(hào)為 JA042930）。

2 方法

2.1 色譜條件

本次實(shí)驗(yàn)選用Waters XBridge Shield RP18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）。將柱溫設(shè)置為30℃；將流量設(shè)置為1.0 ml·min-1；將進(jìn)樣量設(shè)置為50 μl；將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm；將流動(dòng)相的比例設(shè)置為乙腈-磷酸鹽緩沖液（45:55）。磷酸鹽緩沖液的制作方法是：取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用濃度為20%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.2。

2.2 溶液的配置

2.2.1 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿奇霉素糖漿5 ml。然后，將5 ml的阿奇霉素糖漿與甲醇、水（甲醇與水的比例為1:1）進(jìn)行溶解。精密稱(chēng)取50 μl的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將其注入液相色譜儀，并記錄色譜圖。

2.2.2 阿奇霉素對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿奇霉素對(duì)照品10 mg，將其放入 10 ml的容量瓶中后，加入 1 ml的甲醇，充分搖勻使其溶解。然后，再加入甲醇、水（甲醇與水的比例為1:1），稀釋至刻度線。精密稱(chēng)取50 μl的阿奇霉素對(duì)照品溶液，將其注入液相色譜儀，并記錄色譜圖。

2.2.3 阿奇霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取阿奇霉素對(duì)照品0.25 g，將其放入25 ml的容量瓶中后，加入甲醇、水（甲醇和水的比例為1:1）進(jìn)行溶解。

2.2.4 阿奇霉素陰性對(duì)照溶液的制備 按照阿奇霉素糖漿的制備工藝制備阿奇霉素陰性對(duì)照溶液。阿奇霉素陰性對(duì)照溶液的制備方法同阿奇霉素對(duì)照品溶液的制備方法。精密稱(chēng)取50 μl的阿奇霉素陰性對(duì)照溶液，將其注入液相色譜儀，并記錄色譜圖。

2.3 各溶液色譜行為

實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液中阿奇霉素的出峰時(shí)間為12 min，而阿奇霉素糖漿陰性對(duì)照溶液未出峰。分別對(duì)阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液進(jìn)行酸堿破壞、光線破壞、氧化破壞和高溫破壞，其主峰旁相鄰的雜質(zhì)峰與主峰的分離度符合要求，阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液主峰旁未出現(xiàn)干擾峰。由此可見(jiàn)，該檢定方法的專(zhuān)屬性較強(qiáng)。詳情見(jiàn)圖1～3。

圖1 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

圖2 阿奇霉素糖漿陰性對(duì)照液色譜圖

圖3 阿奇霉素糖漿對(duì)照品色譜圖

2.4 耐用性試驗(yàn)

2.4.1 流動(dòng)相pH值的影響 分別配制pH值為8.0、8.2、8.4的磷酸鹽緩沖液，并將不同pH值的磷酸鹽緩沖液與乙腈進(jìn)行混合（磷酸鹽緩沖液與乙腈的比例為45:55）配制成三種不同pH值的流動(dòng)相。在阿奇霉素對(duì)照品溶液和阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入流動(dòng)相進(jìn)行溶解，稀釋至刻度線后進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，阿奇霉素的峰面積隨著pH值的降低而逐漸變小。這三種不同pH值的流動(dòng)相RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）均為0.5%，流動(dòng)相的平均pH值為（8.2±0.2），理論塔板數(shù)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定及要求。

2.4.2 流動(dòng)相比例的影響 配制pH值為8.2的磷酸鹽緩沖液，并將其與乙腈按照不同的比例（40:60、45:55、50:50）進(jìn)行混合，配制成三種不同比例的流動(dòng)相。在阿奇霉素對(duì)照品溶液和阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入流動(dòng)相進(jìn)行溶解，稀釋至刻度線后進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，隨著乙腈比例的逐漸增加，阿奇霉素的峰值越高，其峰面積越大。這三種不同比例的流動(dòng)相RSD均為0.6%，流動(dòng)相乙腈的平均比例為（55±5）%，理論塔板數(shù)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定及要求。

2.4.3 柱溫的影響 在柱溫為25℃、30℃、35℃的情況下，分別對(duì)阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與阿奇霉素對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，柱溫越低，阿奇霉素出峰的時(shí)間越早。這三種不同柱溫的流動(dòng)相RSD均為0.4%，流動(dòng)相柱溫的平均溫度為（30±5）℃，理論塔板數(shù)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定及要求。該實(shí)驗(yàn)表明，此方法的耐用性較強(qiáng)。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取 0.5 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml和1.5 ml的阿奇霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液，并分別將其放置在10 ml的容量瓶中，然后分別加入甲醇和水(甲醇和水的比例為1:1)進(jìn)行溶解，并稀釋至刻度線。分別取不同濃度的20μl阿奇霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液注入液相色譜儀。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，阿奇霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液的濃度為0.5 mg·ml-1～1.5mg·ml-1，與阿奇霉素峰面積的積分呈良好的線性關(guān)系。詳情見(jiàn)表1。以阿奇霉素濃度為橫坐標(biāo)，所得其峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為y = 3434.5x + 88.46（R2=1.0000）。詳情見(jiàn)圖4。

表1 阿奇霉素濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 阿奇霉素對(duì)照品溶液的回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取 20 mg、25 mg、30 mg 的阿奇霉素對(duì)照品溶液，將其加入到25 ml的容量瓶中后，再加入1 ml的阿奇霉素糖漿，然后，使用流動(dòng)相進(jìn)行溶解，并稀釋至刻度線。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，阿奇霉素對(duì)照品溶液的回收率為99.56%～103.59%，符合回收率的規(guī)定限度（92%～105%）。詳情見(jiàn)表2。

表2 阿奇霉素對(duì)照品的回收率（例數(shù)=9）

2.7 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)

在室溫條件下，將阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液分別放置 0 h、8 h、12 h、21 h 后進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在21 h內(nèi)，阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液均未發(fā)生變色、沉淀等異常現(xiàn)象，其RSD＜1.0%。在21 h后，阿奇霉素對(duì)照品溶液的RSD＞1.0%?？梢?jiàn)，阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液在配制后的12 h內(nèi)較為穩(wěn)定。詳情見(jiàn)表3。

表3 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和阿奇霉素對(duì)照品溶液穩(wěn)定性的結(jié)果

2.8 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品中阿奇霉素含量的測(cè)定

精密稱(chēng)取5 ml的阿奇霉素糖漿（生產(chǎn)批號(hào)分別為20170301、20170302、20170303），將其加入到 100 ml的容量瓶中后，再向容量瓶中加入甲醇和水（甲醇和水的比例為1:1），使其溶解并稀釋至刻度線。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品中阿奇霉素的含量為104.42%～104.79%。詳情見(jiàn)表4。

表4 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品中阿奇霉素含量的測(cè)定（例數(shù)=3）

3 討論

在2015版藥典中，阿奇霉素糖漿及其制劑所用的溶劑多為乙腈，但實(shí)驗(yàn)證明，阿奇霉素糖漿與乙腈不相溶，因此，本次研究中選用甲醇做為溶劑。阿奇霉素糖漿在甲醇中能夠有效地好溶解，但溶解后的溶液易在過(guò)夜后析出晶體。通過(guò)使用溴化鉀壓片對(duì)該晶體進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該晶體與蔗糖的光譜圖相一致，故確定析出的晶體為蔗糖。根據(jù)蔗糖在水中極易溶解的特點(diǎn)，本研究中將溶劑確定為甲醇和水。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，阿奇霉素糖漿在甲醇和水（1：1）中的溶解性良好，放置3天阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液仍能保持澄清，且無(wú)結(jié)晶析出。但阿奇霉素對(duì)照品在甲醇和水中需要使用超聲才能夠有效溶解，故本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行阿奇霉素對(duì)照品溶液制備時(shí)，先加1 ml甲醇使阿奇霉素快速溶解，然后再加入甲醇和水稀釋至刻度線。本次實(shí)驗(yàn)按照2015年版藥典中記載的測(cè)定阿奇霉素含量的色譜條件、流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)為操作依據(jù)。由于阿奇霉素糖漿屬于堿性物質(zhì)，因此，本次實(shí)驗(yàn)中選擇使用耐堿性的色譜柱。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，通過(guò)對(duì)比Waters XBridge TM C18 色 譜 柱（4.6×250 mm，5μm） 與資生堂C18柱發(fā)現(xiàn)，前者的色譜峰峰形良好，出峰時(shí)間較短，故選用 Waters XBridge TM C18 色譜柱。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，阿奇霉素對(duì)照品溶液和阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度均為 0.5 mg·ml-1～ 1.5 mg·ml-1，與阿奇霉素峰面積的積分呈良好的線性關(guān)系。阿奇霉素對(duì)照品溶液的回收率為99.56%～103.59%。這說(shuō)明，高效液相色譜法可用于檢測(cè)阿奇霉素糖漿中阿奇霉素的含量。