張長忠 馮瑤 鄭繪霞

【摘要】 目的：探討PD-L1和P63在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中的表達(dá)及臨床意義。方法：選取2013年1月-2017年10月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的DLBCL患者65例為研究組，另外選取同期反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織患者20例為對(duì)照組。采用免疫組化Envsion法檢測(cè)兩組PD-L1和P63的表達(dá)情況，分析PD-L1、P63的表達(dá)與DLBCL臨床病理特征之間的關(guān)系，并分析DLBCL組織中PD-L1與P63表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：研究組中PD-L1、P63的陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組（P<0.05），且P63在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中均呈陰性；PD-L1、P63的表達(dá)均與DLBCL患者年齡、性別、分期、發(fā)生部位及LDH水平無相關(guān)性（P>0.05）；但PD-L1表達(dá)與DLBCL患者IPI評(píng)分相關(guān)（P<0.05），P63表達(dá)與DLBCL患者IPI評(píng)分無相關(guān)性（P>0.05）；在DLBCL組織中，PD-L1與P63的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.252，P=0.043）。結(jié)論：PD-L1、P63在DLBCL中均有表達(dá)，有助于診斷和預(yù)后評(píng)估。

【關(guān)鍵詞】 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤； PD-L1； P63； 表達(dá)； 臨床意義

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 and P63 in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）.Method：A total of 65 DLBCL patients in the First Hospital of Shanxi Medical University from January 2013 to October 2017 were selected as study group，and 20 patients with reactive lymph node hyperplasia were selected as control group.Immunohistochemical Envsion method was used to detect the expression of PD-L1 and P63 in two groups.The relationship between the expression of PD-L1 and P63 and the clinicopathological features of DLBCL was analyzed，and the correlation between the expression of PD-L1 and P63 in the DLBCL tissues was analyzed.Result：The positive rates of PD-L1 and P63 in study group were higher than those of control group（P<0.05），and P63 was negative in reactive hyperplastic lymph nodes.There was no correlation between the expression of PD-L1 and P63 with age，sex，staging，location and LDH level of DLBCL patients（P>0.05），but the expression of PD-L1 was associated with IPI score in DLBCL patients（P<0.05），and there was no correlation between P63 expression and IPI score in DLBCL patients（P>0.05）.In DLBCL tissues，PD-L1 was positively correlated with P63 expression（r=0.252，P=0.043）.Conclusion：Both PD-L1 and P63 are expressed in DLBCL，which is helpful for diagnosis and prognosis evaluation.

【Key words】 Diffuse large B cell lymphoma； PD-L1； P63； Expression； Clinical significance

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.002

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見的一類非霍奇金淋巴瘤（NHL），占NHL的30%～40%。DLBCL的臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)學(xué)、免疫表型、分子遺傳學(xué)特征極具異質(zhì)性[1]。目前，聯(lián)合化療可以使大約45%的患者達(dá)到持續(xù)緩解，但仍有大部分DLBCL患者不能達(dá)到緩解，或出現(xiàn)緩解后復(fù)發(fā)。因此通過多種檢查手段早期識(shí)別DLBCL預(yù)后較差的亞群，對(duì)于預(yù)后判斷和治療選擇具有重要作用。目前臨床上有效預(yù)測(cè)療效或復(fù)發(fā)的指標(biāo)是國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI），IPI主要是一些臨床指標(biāo)的結(jié)合，不包括腫瘤細(xì)胞的分子指標(biāo)[2]。近年來，隨著對(duì)DLBCL發(fā)病機(jī)制的深入研究，有研究認(rèn)為腫瘤分子指標(biāo)可能對(duì)DLBCL的診斷、治療及預(yù)后有很高價(jià)值。程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）又名B7-H1，是B7家族的新成員，是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤免疫逃逸有關(guān)的重要分子之一[3]。PD-L1可以與程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）特異性結(jié)合，從而控制免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，產(chǎn)生抑制性反應(yīng)，T細(xì)胞的活化、增殖被抑制，導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡，不能很好地發(fā)揮T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。國外一些研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤和尿路上皮癌等組織中可以檢測(cè)到PD-L1蛋白的異常表達(dá)，且PD-L1的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[4]。P63屬于P53基因家族，眾所周知P53是一種腫瘤抑制基因，其基因的失活對(duì)腫瘤形成起重要作用。P63在腫瘤發(fā)生機(jī)制中所起的作用目前還不清楚。目前研究證實(shí)P63與組織發(fā)育密切相關(guān)，并可促進(jìn)腫瘤的生長[5]。PD-L1、P63在DLBCL中的表達(dá)以及表達(dá)的相關(guān)性國內(nèi)外研究比較少見。因此本文通過免疫組化法觀察DLBCL組織中PD-L1和P63的表達(dá)，分析PD-L1、P63表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征之間的關(guān)系，并分析DLBCL中PD-L1與P63表達(dá)的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2017年10月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的DLBCL患者65例為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：DLBCL患者術(shù)前均未經(jīng)任何形式的放化療及靶向治療；DLBCL患者均獲取足夠組織，均常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、HE染色，并進(jìn)行免疫組化檢查，切片由兩名主任醫(yī)師確診為DLBCL，符合DLBCL的WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：沒有常規(guī)病理確診的患者（常規(guī)病理不符合DLBCL的診斷標(biāo)準(zhǔn)）；臨床病理資料不完整的患者；合并其他組織部位的惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者。另外選取同期反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織患者20例為對(duì)照組?；颊呔鶎?duì)本研究知情，且本研究已經(jīng)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 采用免疫組化Envsion法進(jìn)行免疫組化染色，P63、PD-L1抗體購自福州邁新公司和Dako公司。染色步驟：取選好的組織蠟塊置于切片機(jī)，一般4 μm厚；將石蠟切片置于烤片機(jī)烘烤2～3 h；常規(guī)脫蠟；使用檸檬酸鹽在高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)；用磷酸鹽緩沖液沖洗后加一抗，放入37 ℃孵箱2 h；再次磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加二抗，蓋過組織，放入37 ℃孵箱25 min；再次磷酸鹽緩沖液沖洗，用移液管滴加DAB顯色劑；放入蘇木精罐復(fù)染約5 min；涼水沖洗-1%鹽酸酒精-涼水沖洗-氨水-涼水沖洗；乙醇脫水，二甲苯透明；滴加樹脂封片。免疫組化已設(shè)置陽性、陰性對(duì)照。免疫組化結(jié)果判定：PD-L1陽性部位為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，陽性閾值為10%[7]；P63陽性部位為細(xì)胞核，陽性閾值為30%[8]。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩組PD-L1與P63表達(dá)情況；分析PD-L1、P63的表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系；分析PD-L1與P63在DLBCL中表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析PD-L1和P63在DLBCL組織中表達(dá)的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 研究組男34例，女

31例；發(fā)病年齡40～85歲，平均（63.00±11.32）歲；AnnArbor分期：Ⅰ期、Ⅱ期32例，Ⅲ期、Ⅳ期33例；淋巴結(jié)內(nèi)病灶32例，結(jié)外病灶33例；乳酸脫氫酶（LDH）正常者32例，升高者33例；淋巴瘤國際預(yù)后（IPI）評(píng)分：0～2分者32例，IPI評(píng)分>2分者33例；生發(fā)中心型25例，非生發(fā)中心型40例。對(duì)照組男11例，女9例；年齡35～70歲，平均年齡（55.00±9.50）歲。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組中PD-L1與P63表達(dá)情況比較 研究組中PD-L1、P63的陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組（字2=3.856、8.047，P<0.05），且P63在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織中均呈陰性。見表1和圖1～4。

2.3 PD-L1、P63的表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系 PD-L1、P63的表達(dá)均與DLBCL患者年齡、性別、分期、發(fā)生部位及LDH水平無相關(guān)性（P>0.05）；但PD-L1表達(dá)與DLBCL患者IPI評(píng)分相關(guān)（P<0.05）；P63表達(dá)與DLBCL患者IPI評(píng)分無相關(guān)性（P>0.05）。見表2。

2.4 PD-L1與P63在DLBCL中表達(dá)的相關(guān)性分析 在DLBCL組織中，PD-L1與P63的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.252，P=0.043）。見表3。

3 討論

有研究證實(shí)心肌、骨骼肌、胎盤、肺等組織中可以檢測(cè)到PD-L1 mRNA，而正常組織中卻很少能檢測(cè)到PD-L1蛋白的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在人體巨噬細(xì)胞系如扁桃體副皮質(zhì)區(qū)的組織細(xì)胞、肝臟巨噬細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等可檢測(cè)到PD-L1蛋白的表達(dá)[3]。除了在免疫部位表達(dá)，PD-L1也表達(dá)于各種非造血細(xì)胞如上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[4]。PD-L1在淋巴組織和非淋巴組織上的表達(dá)，說明PD-L1可以調(diào)節(jié)這些組織的炎癥反應(yīng)以及自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞。近年來，隨著PD-1/PD-L1通路抗體以及cART細(xì)胞免疫療法的陸續(xù)上市，腫瘤免疫療法成為一個(gè)炙手可熱的研發(fā)領(lǐng)域。免疫治療給非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤、白血病等疾病來了新的治療希望。PD-L1參與腫瘤免疫逃逸并且利用PD-L1進(jìn)行腫瘤免疫治療的相關(guān)研究，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。

T細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞的重要細(xì)胞。激活T細(xì)胞需要兩個(gè)信號(hào)分別是抗原肽-MHC分子復(fù)合物與T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）相互作用的抗原特異性信號(hào)，以及共刺激分子所表達(dá)的共刺激信號(hào)[9]。兩個(gè)信號(hào)同時(shí)作用時(shí)，才能激活T細(xì)胞，并維持T細(xì)胞的正常功能。PD-L1與PD-1的特異性結(jié)合可以抑制T細(xì)胞功能，機(jī)體免疫受到抑制，最終抑制了T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[3]。研究表明PD-L1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如胃癌、肺癌、肝癌、宮頸癌、淋巴瘤、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、尿路上皮癌等。由于PD-L1的高表達(dá)抑制了T細(xì)胞的功能，PD-L1的表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[10]。Konishi等[11]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除標(biāo)本中PD-L1表達(dá)陽性，并且發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性區(qū)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞比PD-L1陰性區(qū)顯著減少，提示PD-L1在抗腫瘤免疫中的負(fù)性調(diào)控作用。Andorsky等[4]研究認(rèn)為，間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL）和一些DLBCL組織中表達(dá)PD-L1，且局限于非生發(fā)中心起源的DLBCL中，腫瘤細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)抑制了殺傷性T細(xì)胞的活性。在DLBCL中，可能通過PD-LI的過表達(dá)來進(jìn)行免疫逃避，從而促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的生長。本研究結(jié)果顯示，PD-L1在DLBCL組織和反應(yīng)性增生淋巴組織中均有表達(dá)，且研究組中PD-L1陽性表達(dá)率高于對(duì)照組（P<0.05），與文獻(xiàn)[12]報(bào)道相符。PD-L1在多種腫瘤中都有過高表達(dá)的現(xiàn)象，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，PD-L1表達(dá)越高，預(yù)后越差[13]。本研究結(jié)果顯示，IPI>2分的DLBCL中PD-L1的表達(dá)明顯高于IPI≤2分的DLBCL（P<0.05）。眾所周知，IPI評(píng)分高，提示DLBCL預(yù)后差，本研究中PD-L1在IPI積分高的患者表達(dá)也高，提示預(yù)后也差。

P63基因是腫瘤抑制因子P53基因家族中的一員，結(jié)構(gòu)與P53類似，位于染色體3q27-3q29。P63包含兩種亞型：TAp63和△Np63。兩者功能有明顯的差異：TAp63表達(dá)升高會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；△Np63表達(dá)升高會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡，具有癌基因功能[14]。P63對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和胚胎、表皮發(fā)育至關(guān)重要。目前有研究發(fā)現(xiàn)，P63在淋巴瘤中異常表達(dá)，與淋巴瘤的增殖和凋亡有相關(guān)性，認(rèn)為P63在淋巴瘤中可能起癌基因作用[15-21]。P63異常表達(dá)和結(jié)構(gòu)異常可以在多種類型的淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)[20-21]。還有研究發(fā)現(xiàn)，P63的表達(dá)與惡性淋巴瘤細(xì)胞的分化階段有相關(guān)性，P63高表達(dá)于特殊類型如T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤[16]。檢測(cè)P63對(duì)淋巴瘤的診斷、惡性程度的判斷、臨床療效及預(yù)后的判斷起重要作用。此外，F(xiàn)ukushima等[5]發(fā)現(xiàn)，P63在34%的DLBCL腫瘤細(xì)胞中核表達(dá)，并且P63陽性的非生發(fā)中心DLBCL預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示，P63在DLBCL中陽性率為30.8%，而在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)呈陰性表達(dá)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步提示P63在DLBCL中起癌基因作用。

近年來，一些研究表明PD-L1的高表達(dá)可能是由許多癌基因或者遺傳變異引起的。據(jù)報(bào)道PTEN的功能喪失可能會(huì)上調(diào)腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，導(dǎo)致PD-L1的過表達(dá)[18]。有趣的是，Georgiou等[19]發(fā)現(xiàn)DLBCL中存在PD-L1和P63之間的易位，并且RNA測(cè)序數(shù)據(jù)也表明，PD-L1的高表達(dá)是伴隨著P63的表達(dá)。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在多種腫瘤細(xì)胞中異常激活，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，在DLBCL惡性進(jìn)展過程中，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被PD-1/PD-L1直接激活[21]。同樣的，P63可以調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)，這在DNA損傷的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[22]。因此，本研究推測(cè)PD-L1/P63的表達(dá)可能激活一些重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，在DLBCL組織中，PD-L1與P63的表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)性不是特別明顯，可能與樣本量小有關(guān)。

綜上所述，本研究表明PD-L1和P63在一些DLBCL中高表達(dá)；PD-L1和P63與患者預(yù)后不良相關(guān)，為預(yù)后不良的指標(biāo)；PD-L1與P63在DLBCL組織中顯示微弱的相關(guān)性，還需要更大的樣本量和進(jìn)一步的研究來研究PD-L1和P63的表達(dá)是否有協(xié)同作用，以及是否PD-L1和P63的轉(zhuǎn)錄融合在DLBCL的進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵的作用。

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