霍麗珺 凌均棨

牙菌斑是多細菌性生物膜，變異鏈球菌與眾多細菌共存其中。常規(guī)的檢測方法難以將變異鏈球菌從生物膜中分離出來。目前已有學(xué)者將熒光素酶報告系統(tǒng)用于檢測抗菌劑對細菌的作用，并獲得成功[1-2]。本課題組前期成功構(gòu)建了變異鏈球菌ldh-luc基因熒光報告株，已證實可用其代替野生株進行相關(guān)實驗研究[3-4]。為驗證本課題組前期構(gòu)建的變異鏈球菌ldh-luc基因熒光報告株在生物膜狀態(tài)下對抗菌劑的敏感性，本實驗采用氯己定作用于S.mutansldh-luc基因熒光報告株，觀察其生長狀態(tài)及熒光活性的變化及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗所用菌株及相關(guān)特性見表 1。

1.2 方法

1.2.1 氯己定對S.mutansldh-luc基因熒光報告株和野生株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MICs)S.mutanUA 159野生株復(fù)蘇接種至10 ml心腦浸出液(brian heart infusion,BHI,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)液體培養(yǎng)基，S.mutansldh-luc基因熒光報告株(下文簡稱熒光報告株)復(fù)蘇接種至含有250 μg/ml大觀霉素(spectinomycin,Spec,Sigma,USA)的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜。次日菌液1∶20稀釋于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2.5 h，調(diào)整菌液濃度為105～106CFU/ml。吸取50 μl無菌BHI培養(yǎng)基加入圓底96 孔板1～12 孔中，往第1列孔中加入40 μl BHI 培養(yǎng)基，加入10 μl 1 mg/ml氯己定(Sigma,USA)溶液，吹打混勻。吸取第1孔中的50 μl加入第2孔中，吹打混勻，再吸取50 μl加入第3孔，依次進行序列稀釋，直至第10孔，棄去50 μl，然后往第1～12孔中加入50 μl BHI培養(yǎng)基。再吸取100 μl菌液加入96 孔板中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果。其中第11孔為陰性對照，為不含抗菌劑的細菌菌液，第12孔為空白對照，不含細菌的新鮮培養(yǎng)基。吸取100 μl菌液序列稀釋后涂板，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜，菌落計數(shù)。MICs為未見活菌生長孔的最低濃度。每濃度3 個重復(fù)，實驗重復(fù)3 次。

表 1 本實驗所用菌株

1.2.2 浮游態(tài)熒光報告株對氯己定的敏感性實驗

熒光報告株復(fù)蘇接種至含250 μg/ml Spec的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜。次日菌液1∶20稀釋于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2.5 h，調(diào)整菌液濃度為～108CFU/ml。菌液中加入氯己定，終濃度為1 μg/ml，37 ℃厭氧培養(yǎng)。30 min、60 min時吸取菌液加入96 孔白板，每孔200 μl，每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin(Promega,USA)，發(fā)光檢測分析儀(Berthold centro LB960,Tecan,Austra)測相對光單位值RLU(Relative light unit,RLU)，未加D-luciferin的菌液為空白對照。經(jīng)氯己定處理60 min菌液離心(4 000 g)5 min，棄上清，加入0.5%蔗糖的BHI培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)。在30、60和90 min時將菌液吹打混勻后加入96孔白板和96孔透明板中。96孔白板每孔200 μl菌液，加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，測RLU，未加D-luciferin的菌液為空白對照。96孔透明板中每孔200 μl菌液，酶標儀(Infinite,Tecan,Austra)測A600；取100 μl序列稀釋后涂板于含250 μg/ml Spec的BHI瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)(colony forming units,CFU)。每組3 個樣本，實驗重復(fù)3 次。采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0，應(yīng)用單因素方差分析氯己定作用后熒光報告株活性(A600,CFU,RLU)的差異，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 生物膜狀態(tài)熒光報告株對氯己定敏感性實驗

熒光報告株復(fù)蘇接種至含有250 μg/ml Spec的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜。次日菌液1∶20稀釋于0.5%蔗糖BHI培養(yǎng)基中，接種至平底96孔白板和透明板中，每孔200 μl，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，形成生物膜。棄上清，加入200 μl 0.5%蔗糖BHI培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)30 min，96孔白板每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，測RLU，未加D-luciferin菌液為空白對照。96孔透明板中生物膜吹打混勻，測A600，吸取100 μl菌液，序列稀釋后涂布于含250 μg/ml Spec的BHI瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)。將氯己定加入上述96孔白板中的生物膜，終濃度為10 μg/ml，37 ℃厭氧培養(yǎng)。在30、60 min時，每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，測RLU，未加D-luciferin菌液為空白對照。經(jīng)氯己定處理60 min生物膜棄上清，加入0.5%蔗糖BHI培養(yǎng)基200 μl，37 ℃厭氧培養(yǎng)。在30、60和90 min時，每孔加入50 μl 1 mmol/L D-luciferin，發(fā)光檢測分析儀測RLU，未加D-luciferin的菌液為空白對照。在30、60和90 min時，將生物膜振蕩吹打混勻，取200 μl加入96孔透明板中，酶標儀測其A600；取100 μl序列稀釋后涂于含250 μg/ml Spec的BHI瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)。每組3 個樣本，實驗重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0，應(yīng)用單因素方差分析氯己定作用后熒光報告株活性(A600, CFU, RLU)表達差異，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氯己定對熒光報告株和野生株的MICs

氯己定對熒光報告株和野生株有明顯地抗菌作用。其MICs均為(0.25±0.39) μg/ml(表 2)。

表 2 氯己定對S. mutans ldh-luc基因熒光報告株和野生株的MICs (μg/ml)

2.2 氯己定對浮游態(tài)熒光報告株熒光活性的作用

氯己定對浮游態(tài)熒光報告株的生長狀態(tài)及熒光活性作用如圖 1。圖 1A所示為氯己定處理后熒光報告株RLU的變化情況。氯己定作用30 min后，熒光報告株的RLU呈下降趨勢，作用60 min后，RLU下降至檢測水平以下，移走氯己定，加入BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)30、60、90 min，仍未檢出RLU，未加抗菌劑的陰性對照組的RLU隨細菌的生長而持續(xù)增加。圖 1B所示為熒光報告株經(jīng)氯己定處理前后A600的變化情況。氯己定處理后熒光報告株A600略有下降，而陰性對照組A600平均增加0.3。圖 1C所示為熒光報告株處理前后CFU的情況。氯己定處理后CFU計數(shù)為0，陰性對照組菌液生長良好，CFU計數(shù)增加。這一結(jié)果與熒光報告株處理前后RLU的變化一致，氯己定處理后未檢測到RLU，陰性對照組RLU上升(圖 1D)。氯己定處理前后的CFU計數(shù)和RLU的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 氯己定對生物膜狀態(tài)熒光報告株熒光活性的作用

經(jīng)氯己定作用的24 h生物膜的熒光活性變化與浮游態(tài)熒光報告株相似，氯己定作用24 h生物膜30 min后，RLU呈下降趨勢，作用60 min后RLU降至檢測水平下，移走氯己定，加入BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)30、60、90 min，RLU仍未檢出，未加抗菌劑的陰性對照組RLU隨著細菌的生長而持續(xù)增加。熒光報告株24 h生物膜經(jīng)氯己定作用后的A600(圖 2B)、CFU(圖 2C)和RLU(圖 2D)均下降，陰性對照組的A600、CFU和RLU伴隨細菌的生長均上升。氯己定作用前后的24 h生物膜的CFU計數(shù)和RLU的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖 1 氯己定對浮游態(tài)S. mutans ldh-luc基因熒光報告株熒光活性的作用

圖 2 氯己定對生物膜狀態(tài)S. mutans luc基因熒光報告株熒光活性的作用

3 討 論

活菌計數(shù)法是測定細菌生長狀況的有效方法，該法測出的為活菌總數(shù)，能表示細菌真實的生長情況，但此法操作復(fù)雜，過程繁瑣，頗為費時。近年來，不斷有學(xué)者將熒光素酶報告系統(tǒng)用于檢測抗菌劑對細菌的作用，用作高效篩選抗菌劑的工具獲得了成功，Arain等[1]采用熒光報告株做抗菌劑活性實驗，Shawar等[2]用牛分支桿菌熒光報告株檢測抗菌劑對其的作用，Jawhara等[5]采用大腸桿菌熒光報告株觀察抗菌劑對體內(nèi)傷口的作用，Loeliger等[6]采用戈登鏈球菌熒光報告株檢測了抗菌劑對其的作用。因為內(nèi)源性ATP體現(xiàn)了細胞的代謝狀態(tài)，熒光素酶檢測不用額外加入外源性ATP，可如實反映環(huán)境或外界因素對細菌內(nèi)源性ATP作用而引起細菌生存狀態(tài)的改變，本實驗利用了這一特性，構(gòu)建了S.mutansldh-luc基因熒光報告株用以實時觀測抗菌劑對變異鏈球菌的作用[3-4]。由于實時檢測系統(tǒng)必須能反映加入抗菌劑后任一個時間點的細菌狀態(tài)，本實驗采用氯己定作用于浮游態(tài)熒光報告株，觀察其生長狀態(tài)、熒光活性變化及相互關(guān)系，以驗證熒光報告株的有效性。氯己定是一種廣譜抗生素，對多種細菌具有抗菌作用[7]。本實驗結(jié)果顯示氯己定對熒光報告株和野生株的MICs相同，二者對氯己定的敏感性一致。氯己定對浮游態(tài)熒光報告株的生長狀態(tài)及熒光活性作用的結(jié)果顯示，RLU的數(shù)值與活菌計數(shù)法的結(jié)果一致。說明S.mutansldh-luc基因熒光報告株的熒光活性可以實時反映抗菌劑對細菌的作用。因此相對活菌計數(shù)法，熒光素酶的測定方法簡單易行，操作簡便，能快速反映細菌的生長情況，是檢測抗菌劑作用的有效方法。

為了驗證生物膜狀態(tài)下熒光報告株對抗菌劑的敏感性，本實驗采用氯己定作用于生物膜狀態(tài)熒光報告株，觀察其生長狀態(tài)、熒光活性變化及相互關(guān)系。結(jié)果顯示氯己定作用熒光報告株24 h生物膜的熒光活性變化與浮游態(tài)熒光報告株相似，熒光報告株24 h生物膜經(jīng)氯己定作用后的A600、CFU和RLU均下降。統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，氯己定作用前后的24 h生物膜的CFU計數(shù)和RLU的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明在不破壞生物膜結(jié)構(gòu)情況下S.mutansldh-luc基因熒光報告株能準確反映抗菌劑對生物膜狀態(tài)下細菌的作用，與生物膜活菌計數(shù)效果相似，為實時評價抗菌劑對生物膜狀態(tài)下變異鏈球菌的作用提供有效的方法。