劉靜 石晴 李志艷 趙翀 陳筠 朱德銳

口腔營養(yǎng)豐富，適宜的pH及溫度是多種微生物(細菌、病毒和真菌)的棲息地[1]。細菌能保持口腔生態(tài)系統(tǒng)的平衡性，失去平衡時，齲病和牙周病等口腔疾病就會隨之發(fā)生，且與高血壓、類風濕性關節(jié)炎、糖尿病等系統(tǒng)性疾病密切相關[2]。因此，口腔疾病的研究對于其早期的預防、治療及維護人體的健康有至關重要的作用。牙周病和齲病是危害人類口腔健康最普遍的疾病，受遺傳、飲食、生活環(huán)境及文化背景等因素的影響[3]。目前，利用高通量測序技術進行微生物多樣性檢測、宏基因組學和微生物代謝組學研究口腔微生物與臨床疾病的相關性，是國內外研究熱點[4]。

據(jù)報道，對海拔4 000 m以上的2 400 名世居者及移居者進行牙周病學普查，發(fā)現(xiàn)移居者牙周病發(fā)病率高達98.7%，而世居者僅為42.3%，且久居高原者牙周病的患病率(高達70.2%)明顯高于其他地區(qū)[5-7]。國內對于口腔疾病的研究主要是針對低海拔平原地區(qū)的居民，高海拔地區(qū)居民口腔疾病的流行病學研究甚少，且高原口腔微生物研究報道較少。青海地區(qū)地理條件特殊，少數(shù)民族眾多，不同民族聚居生活，各民族之間生活方式存在較大差異。其中，互助縣的土族是青海特有的一個少數(shù)名族，回族和藏族在青海地區(qū)又是人數(shù)比較多的兩個少數(shù)民族，漢族大多是從全國各地移居而來。因此本研究選擇了青海不同地區(qū)的土族，回族與藏族人群為研究對象，采用16S rRNA基因高通量測序技術探究不同人群口腔微生物的多樣性、群落結構差異以及牙周病的可疑致病菌差異，為青海地區(qū)牙周病的預防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象和樣本采集

通過對青?；ブ磷遄灾慰h威遠鎮(zhèn)土族、玉樹州結古鎮(zhèn)藏族、平安縣古城鄉(xiāng)回族居住10 年以上的部分居民進行口腔檢查，選取28 例重度牙周炎患者，年齡在23～85 歲，玉樹藏族(Tibetan，T)有10 例，平安回族(Hui，H)有10 例，互助土族(Monguor，M)8 例，其中男性13 例，女性15 例；對照組(Control，C)年齡40～85 歲，男性6 例，女性6 例。慢性牙周炎患者納入標準：①牙周袋深度(PD)≥4 mm或附著喪失量(AL)≥2 mm；②X線片示牙槽骨吸收超過根長的1/3；③無其他口腔疾病。收集藏族、回族與土族牙周病患者，均無糖尿病、心血管病、甲亢等全身系統(tǒng)性疾病，無嗜煙酒史，3 個月內無抗生素使用史，就診前6 個月內未做口腔治療，無侵襲性牙周炎，無妊娠期或哺乳期。在采集樣本前讓受檢者用溫開水輕輕漱去口中的食物殘渣，然后采集口腔自然排出的唾液于無菌試管內，唾液量0.5～1.0 ml，加入等量的50%滅菌甘油，標記后立即凍存于-4 ℃的轉運箱中保存，送回實驗室，-20 ℃冷凍備用。

1.2 總DNA的提取及質量控制

樣本于0.22 μm 細菌濾膜上進行真空抽濾，將濾膜剪碎放入DNA試劑盒(QI Aamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen,德國)，參照試劑盒步驟提取基因組DNA，2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析唾液樣本DNA完整性。DNA質量純度檢測分析采用微量檢測儀Microplate Reader(MD公司，USA)，合格樣品總DNA保存于-80 ℃。

1.3 PCR擴增16S rRNA和測序分析

細菌使用16S rRNA基因通用引物F341(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和R518(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)進行V3-V4目的基因擴增。PCR反應條件為：95 ℃(5 min)，94 ℃(45 s)，55 ℃(30 s)，72 ℃(90 s)，共35 個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min。采用Axyprep DNA Gel Extraction Kit(Axygen scientific, Inc USA)進行PCR擴增產物純化；采用Qubit?2.0熒光計(Invitrogen, USA)進行RNA精準定量分析。檢測合格的PCR純化產物由上海惠研生物科技有限公司進行16S rRNA基因量測序(MiSeq/454/Sanger, ABI, 3730xl，USA)，每個樣本獲得雙端序列數(shù)據(jù)為2～3 萬個reads。根據(jù)測序reads之間overlap關系進行拼接(merge)，同時對reads質量和merge效果進行質控過濾(Q30>80%)，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分，優(yōu)化有效序列。

1.4 測序結果分析

使用QIIME 1.8.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理，在相似度97%水平上聚類出可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)，進行OTU picking和物種注釋分析。通過Alpha稀釋曲線(Alpha rarefaction)計算樣品的香農指數(shù)(Shannon)、譜系多樣性(PD whole tree)、觀察物種(Observed species)和菌種豐富度指數(shù)Chao1。根據(jù)軟件Cluster 3.0，將屬水平上菌種分別按照樣品和分類進行聚類做出Heatmap圖。根據(jù)分類學分析結果(屬Genera)分析微生物的群落結構、物種組成比例及豐度。

2 結 果

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

通過Illumina MiSeq測序平臺對青海地區(qū)牙周病患者口腔唾液樣本細菌16S rRNA基因(V3-V4區(qū))生物多樣性檢測，共計獲得青海土族12 838 條reads，回族17 640 條，藏族990 條。在相似度97%水平上聚類可操作分類單元OTU，并進行OTU picking，共計獲得青海土族OTU數(shù)目為181、回族OTU 210 個、藏族38 個OTU，3 個民族每個樣本的平均讀長均為250 bp，健康對照組OTU共有14 個。物種多樣性應用軟件Mothur計算Chao1、Shannon指數(shù)、PD whole tree和Observed species(表 1)。土族的Observed species為(21～51 個)，回族的為(28～88 個)，而玉樹藏族的為(7～15 個)，對照組為(1～5 個)，說明土族和回族的可觀察物種數(shù)多，而藏族的物種數(shù)較少，對照組更是單一。Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分析表明土族和回族的微生物多樣性均較高，藏族的多樣性相對較低，對照組的多樣性均小于牙周病各亞組。PD whole tree指數(shù)顯示，牙周病組的微生物系統(tǒng)發(fā)育距離總和(0.86-2.33)大于對照組(0.08-0.63)，表明牙周病組的微生物群落結構較復雜且系統(tǒng)發(fā)育關系亦趨于復雜，而對照組微生物種群進化簡單。

表 1 牙周病組和對照組各個樣本微生物多樣性指數(shù)

圖 1 牙周病(土族、回族、藏族)與對照組的微生物相對豐度統(tǒng)計分析

2.2 種群結構差異分析

利用核糖體數(shù)據(jù)庫(ribosomal database project，RDP)對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在屬層次下對各樣品物種豐度進行統(tǒng)計分析(圖 1)，獲得土族類群11門19綱87屬，回族13門21綱113屬，藏族2門4綱21屬，對照組分為4門5綱12屬。土族和藏族的優(yōu)勢菌明顯均為假單胞菌屬(Pseudomonas)，回族的優(yōu)勢菌種在不同樣本中各不同，主要是未分類的腸桿菌科(Enterobacteriaceae-norank)，嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)，變形桿菌屬(Proteus)，乳球菌屬(Lactococcus)和Pseudomonas。對照組的優(yōu)勢菌主要是耶爾森氏菌(Yersinia)，不動桿菌屬(Acinetobacter)和Pseudomonas。相比而言，牙周病組種群結構復雜多樣，其中藏族組和土族組群落結構組成相對穩(wěn)定，回族組成復雜，而對照組微生物種類較少且單一。

2.3 聚類分析

根據(jù)樣本間的物種豐度和相似性聚類，構建牙周病組Heatmap圖譜(圖 2)?？傮w而言，不同樣本間的優(yōu)勢類群明顯不同，不同民族間亦存在差異，但主要聚類在γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，其中Pseudomonas主要聚集在藏族和土族的樣本中，較單一；而回族的種群聚集較多，主要聚集在Enterobacteriaceae-norank、Proteus和Psychrobacter，其他種群在各個民族中含量均較少。表明牙周病患者口腔內的優(yōu)勢菌種因不同民族而不盡相同，其中土族和藏族相似，而回族與前兩者相比有較大差異。

圖 2 牙周病組聚類Heatmap圖譜分析

2.4 致病微生物差異分析

統(tǒng)計分析牙周病與對照組的微生物相對豐度與致病微生物(表 2)，土族組、回族組和藏族組的致病微生物各有差異，土族和回族種類較多且復雜，而藏族較單一。目前，已知的致病菌梭桿菌屬(Fusobacterium)、普氏菌屬(Prevotella)和卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)在土族組和回族組均有檢出，致病菌消化鏈球菌(Peptostreptococcus)僅在土族組中檢出，致病菌密螺旋體(Treponema)僅在回族組檢出，然而上述已知的致病菌在藏族組均未曾檢出。通過比較分析土族組、回族組、藏族組與對照組，牙周病3個亞組中檢出的可疑致病菌主要有肉食桿菌屬(Carnobacterium)、顆粒鏈球菌屬(Granulicatella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)和Lactococcus；土族和回族組檢出的可疑致病菌主要有凝聚桿菌屬(Aggregatibacter)、奇異菌屬(Atopobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、Bulleidia、彎曲菌屬(Campylobacter)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、奈瑟菌屬(Neisseria)、Oribacterium、小桿菌屬(Dialister)、歐文氏菌屬(Erwinia)、孿生球菌屬(Gemella)、克雷白桿菌屬(Klebsiella)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和Proteus。此外，藏族特有的可疑致病菌為梭菌屬(Clostridium)；土族特有的可疑致病菌為環(huán)絲菌屬(Brochothrix)、卡托菌屬(Catonella)、艾肯菌屬(Eikenella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、微單胞菌屬(Parvimonas)、嗜胨菌屬(Peptoniphilus)和韋榮球菌屬(Veillonella)。

3 討 論

口腔微生物是一個有高度組織的生物膜群體，組成類群極其復雜，多以細菌為主，其生態(tài)系統(tǒng)平衡與人類健康密切相關。目前，已知人類口腔中存在有細菌700 余種，其中獲得純培養(yǎng)的有250 多種[8]。在口腔的不同部位，微生物通過共棲、競爭和拮抗等作用方式，在種群、數(shù)量和功能上構成了復雜的口腔微生物生態(tài)系統(tǒng)，通過協(xié)同或合作等方式引起一系列的口腔疾病，因此探究口腔微生物的群落組成及致病菌，是防止口腔疾病發(fā)生的關鍵。本研究利用高通量測序的方法，對牙周病組(土族、回族與藏族)和對照組的口腔微生物群落進行分析，發(fā)現(xiàn)牙周病組共計土族OTU181 個(11門19綱87屬)、回族OTU 210 個(13門21綱113屬)、藏族38 個OTU (2門4綱21屬)和對照組OTU 14個(4門5綱12屬)，表明青海土族和回族的微生物種群結構組成多樣化，藏族相對簡單。此外，牙周病組的多樣性指數(shù)Shannon、豐度指數(shù)Chao1和可觀察物種數(shù)均高于對照組，說明牙周病組的微生物復雜多樣且種群結構發(fā)生巨大變化。

牙周病是一種牙周組織慢性感染性炎癥性疾病。已經確定的牙周致病微生物主要有牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)、齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)、福賽斯坦納(Tannerellaforsythensis)、中間普氏菌(Prevotellaintermedia)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)、伴放線放線菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、纏結優(yōu)桿菌(Eubacteriumnodatum)、牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonasendodontalis)和Peptostreptococcus[9-11]。丁倩等[12]研究的關于新疆維吾爾族和漢族的牙周病致病菌主要是Porphyromonasgingivalis、Tannerellaforsythensis和Prevotellaintermedia。本研究中不同民族的牙周致病菌不同，土族組和回族組共有的已知致病菌有梭桿菌屬(Fusobacterium)、普氏菌屬(Prevotella)和卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)，僅在土族組中的致病菌為Peptostreptococcus，回族中僅有的致病菌為Teponema，而藏族組未檢出已知的致病菌?？芍?，青海三大民族牙周病的致病菌與其他地區(qū)的其他民族存在差異，可能是不同民族、生活習慣和居住環(huán)境不同引起的。

表 2 牙周病組與對照組的口腔微生物統(tǒng)計分析

注：①未明確分類的細菌；—：未檢出

通過比較分析牙周病亞組(互助土族組、平安回族組、玉樹藏族組)與對照組發(fā)現(xiàn)，牙周病3 個亞組中亦檢出大量可疑致病菌，3 個民族間的可疑致病菌既有相似性，又有差異，且每個民族中還存在特有的可疑致病菌。土族和回族相同的可疑致病菌有18 種，而藏族與土族和回族的可疑致病菌之間存在較大差異，共有的致病菌僅有5 種。此外，土族檢測的特有可疑致病菌有7 種，回族特有的為2 種，其余均與土族相同，而玉樹藏族的特有可疑致病菌僅有1 種-Clostridium，該菌為厭氧菌，藏族生活在海拔較高的低氧環(huán)境中，利于厭氧菌的生長繁殖，因此Clostridium僅為藏族牙周病患者的可疑致病菌。對比發(fā)現(xiàn)，回族和土族的可疑致病菌存在相似性且復雜多樣，而藏族的可疑致病菌與前兩者相比不僅差別較大，而且種類較單一，這與他們的生活習慣和居住環(huán)境有密切關系。另外與乳制品有關的Lactococcus和Leuconostoc、與鹽堿環(huán)境有關的Halomonas、Carnobacterium和Citrobacter是青海牙周病的特有可疑致病菌；Acinetobacter、Pseudomonas、Psychrobacter和Streptococcus存在牙周病組和對照組中為青海特有的口腔微生物，可能與不同民族間生活習慣和高原特殊環(huán)境不同有關。與劉莉等[13]和吳芳等[14]的研究結果相比，青海土族、回族與藏族的致病微生物及可疑致病菌更復雜多樣且優(yōu)勢均屬明顯不同。

青海牙周病組(土族、回族、藏族)和對照組相比，口腔微生物的群落結構、豐度比例及致病菌存在明顯差異，可能是生活習慣、居住條件、飲食、環(huán)境等因素對口腔微生物群落結構的變化產生重要的影響，導致各民族間的致病微生物產生較大差異[15-16]。如高原特殊環(huán)境使機體各系統(tǒng)各器官產生不同程度的缺氧，使厭氧菌生長繁殖加快，且在低氧環(huán)境下，口腔內唾液分泌減少，口腔自潔功能減弱，加速了厭氧細菌的生長和菌群的形成，從而引起牙周病[13,17]。玉樹藏族人群世居于平均海拔4 000 m以上的青藏高原牧區(qū)，與外界接觸較少，衛(wèi)生條件差，以牛羊肉和奶制品為主食，這是導致口腔微生物群落結構與其他民族間產生差異的主要原因，亦是藏族口腔微生物群落結構簡單的主要原因。土族和回族則以大雜居的生活方式為主，與外界接觸較多，飲食以面食為主，居住環(huán)境海拔較低，這使他們形成了復雜多樣的微生物群落結構。青海人群的飲食與生活習慣，居住環(huán)境等與平原地區(qū)民族存在明顯不同，致使牙周病致病菌產生較大差異。環(huán)境因素和不同民族直接或間接地影響著口腔微生物的群落結構，是造成牙周致病菌產生差異的主要原因。

綜上述，本研究中青海三大民族(土族、回族和藏族)牙周病相關微生物的群落結構及多樣性均復雜于對照組；其次，3 個民族牙周病的致病菌、可疑致病菌之間亦存在差異，且每個民族均存在特有致病菌。本研究中的3 個民族均為少數(shù)民族，需要對其他民族和地區(qū)的牙周病患者進行系列研究進一步探討牙周病與民族間的關系。另本研究取樣僅選擇唾液樣本，而致病菌可能大量存在牙體的病損處，因此后續(xù)研究將進一步改進，進行多部位取樣。