余心華 張 華 張 波 祝雪毅

(1 棗陽市婦幼保健院婦產科,2 棗陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科,棗陽 441200)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的主要類型之一,也是全球范圍內女性第二常見的惡性腫瘤和第一常見的腫瘤死亡原因[1]。患者5年生存率可達40%以上[2]。然而,由于晚期卵巢腫瘤高復發(fā)率和轉移率,晚期卵巢癌的預后很差[3]。因此,需要進一步研究卵巢癌發(fā)生進展的分子機制,尋找有效的治療方式。最近研究表明,生物體內存在長度超過200nt的長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種惡性腫瘤細胞的致癌和發(fā)育過程中起著關鍵的生物學作用[4]。lncRNA可用于不同類型的惡性腫瘤的診斷和預后指標,并且可作為惡性腫瘤治療的潛在靶標[5-6]。在卵巢癌中,一些差異表達的lncRNA,例如HULC[7]、MEG3[8]、GAS5[9]等,已被證實在卵巢癌中起到腫瘤啟動因子或抑制因子的作用[10]。ANRIL在多種惡性腫瘤中均存在表達異常的現象,且對腫瘤的發(fā)展及行為具有一定的影響作用,ANRIL已被認為是一種致癌基因,在很多腫瘤中發(fā)揮作用[11-17]。然而,ANRIL在卵巢癌中的生物學作用和臨床意義未進行全面的研究和揭示。本研究評估了ANRIL和miR-214在卵巢癌細胞中的表達狀態(tài),并進一步探討ANRIL與miR-214之間的相互作用,研究其在卵巢癌的增殖和侵襲過程中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 臨床標本采集與處理

收集2016年7月～ 2017年1月在醫(yī)院手術切除并且經病理檢查確診為卵巢癌的組織70例,同時取癌旁正常組織70例。離體后放入4%多聚甲醛中固定。全部患者術后病理分期明確,所有患者術前無化療或放療,卵巢癌為原發(fā)病灶并經病理科證實,簽署知情同意書。

1.2 細胞株與主要試劑

人卵巢癌Ovcar3、COC1、A2780和SKOV3細胞株均購買于復旦大學細胞庫。細胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI 1640,37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司;Transwell小室購自美國Millipore公司;Matrigel購自美國BD公司;ANRIL、miR-214及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術有限公司;Lipofectamine2000轉染試劑購于日本TaKaRa公司;逆轉錄試劑盒(FSQ-101)購自日本TOYOBO公司;PCR試劑盒購自美國Sigma公司;熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成;裸鼠購買于復旦大學實驗動物中心。

1.3 qPCR實驗檢測miR-214的表達

使用miRNA提取試劑盒進行mRNA抽提,實驗過程按照試劑盒使用說明進行,抽提之后,使用核酸濃度檢測儀檢測RNA濃度和純度,最后將其濃度稀釋至40μg/ml,使用特異性反轉錄引物進行cDNA合成,反應條件按照cDNA合成試劑盒使用說明進行設置。反應條件：95℃預變性10min、95℃變性15s、60℃退火32s,循環(huán)50次后檢測其溶解曲線,檢測完成后,通過計算機系統(tǒng)自動分析各樣本Ct值,然后采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達量。實驗重復3次。ANRIL引物序列：5′-CTGCTGTAGTCGTAGTCGGTAAG AC-3′(正向)和5′-GCGCGTAGTCGTAGCGGTTAT GGCT-3′(反向)。miR-214引物序列：5′-CGTAGCG TAGGCTGACGTAGGTTTC-3′(正向)和5′-TGTG CCAGGGCTAAAGCTAGCAAAC-3′(反向)。

1.4 雙熒光素酶實驗檢測miR-214和ANRIL之間關系

從人類基因組DNA產生全長miR-214-3′UTR,并通過退火合成的信號寡核苷酸產生突變體miR-214-3′UTR。將這些DNA片段克隆到ph-TK載體(腎熒光素酶)中,miR-214-3′UTR WT代表野生型質粒載體和質粒結合共轉染到293T細胞內,miR-214-3′UTR MUT代表突變型質粒載體和質粒結合共轉染到293T細胞內,同時使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內參照,檢測NC組和ANRIL-siRNA組293T細胞中miR-214的熒光活性相對值。使用Lipofectamine 2000TM(Invitrogen)檢測轉染效率在孢菌素酶活性的基礎上正?；?。根據制造商的說明書,使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒(Promega)測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性,通過雙熒光素酶檢測ANRIL對miR-214的表達活性的調控能力,明確MALAT1對miR-205熒光活性的調控情況。

1.5 Transwell侵襲試驗檢測卵巢癌細胞侵襲能力

將5×104個SKOV3卵巢癌細胞置于模具上室,并加入Matrigel基質膠,涂抹均勻。將具有10%FBS的培養(yǎng)基置于下室中。在37℃下孵育24h后,小心地去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20min后,用0.5%結晶紫溶液染色10min,自來水沖洗干凈過后,于倒置顯微鏡下計數。實驗重復3次。

1.6 克隆形成實驗檢測卵巢癌細胞增殖能力

使用常規(guī)培養(yǎng)的SKOV3的細胞經胰酶消化后,1000r/min,3min,棄去上清液。加入5ml的無菌PBS溶液,輕輕吹散洗滌細胞沉淀并再次離心。反復洗滌3次后加入培養(yǎng)基,制備成單細胞懸液。測定細胞濃度并調整為1000cells/ml,將單細胞懸液均勻的種植在無菌6孔板內,進行克隆形成實驗。分為NC組實驗組和ANRIL-siRNA對照組。每3d更換培養(yǎng)基1次,14d后觀察細胞克隆形成情況。

1.7 MTT細胞增殖實驗檢測卵巢癌細胞增殖能力

消化離心重懸SKOV3細胞,分為轉染細胞組和未轉染細胞組,使用96孔板,設置3個復孔,每空加入2×103細胞,稀釋TGFβ1因子濃度為200ng/ml,在37℃、5% CO2的孵箱內培養(yǎng)。培養(yǎng)后的1～5d分別按每100μl培養(yǎng)基加入10μl CCK-8液體,放于細胞培養(yǎng)箱內孵育1h,用酶標儀在450nm下檢測各孔吸光值。以時間為橫軸,以每個時間點各組細胞的吸光值比率為縱軸,繪制細胞生長曲線。

1.8 裸鼠動物實驗檢測miR-214對成瘤能力的影響

給5周齡的裸鼠腋下皮下注射卵巢癌細胞株(5×105個細胞)。此后每周監(jiān)測腫瘤大小。6周后,將小鼠處死并除去腫瘤,處死后檢測兩組(各10只)裸鼠腫瘤異種移植物的質量生長情況。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 lncRNA ANRIL和miR-214在卵巢癌組織和細胞株中的表達情況

qPCR結果表明(圖1A),與正常卵巢組織相比,ANRIL在卵巢癌組織中的表達水平明顯升高[(1.35±0.11)vs(3.18±0.21),P<0.05],miR-214在卵巢癌組織中的表達水平也相對升高[(2.25±0.19)vs(5.67±0.42),P<0.05],差異均具有統(tǒng)計學意義。與其他細胞株相比,SKOV3細胞中ANRIL mRNA表達水平明顯較高[(10.02±0.18)vs(3.05±0.10),P<0.05],差異有統(tǒng)計學意義;ANRIL在SKOV3細胞株中表達水平比其他卵巢癌細胞株較高(圖1B)。綜合上述實驗結果,考慮ANRIL在卵巢癌中可能有一定的致癌作用,而miR-214也可能發(fā)揮一定的促癌效果,后續(xù)挑選SKOV3為生物學功能實驗的細胞株。

2.2 lncRNA ANRIL與卵巢癌患者臨床病理參數之間的關系

為了證實ANRIL在卵巢癌組織標本中的表達與其臨床病理參數之間關系，把70例卵巢癌腫瘤組織樣本和癌旁正常卵巢組織進行臨床病理參數的統(tǒng)計分析。ANRIL在不同年齡的卵巢癌患者之間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。ANRIL的表達與卵巢癌的病理分期相關以及淋巴結轉移情況有關,隨著分期越高,ANRIL在卵巢癌組織中表達越高,而在有淋巴結轉移的患者中ANRIL的表達也相對較高(P<0.05,表1)。

表1 ANRIL表達與卵巢癌患者臨床病理特征之間的關系

2.3 lncRNA ANRIL和miR-214之間的相互調控關系

為明確與ANRIL相關的miRNA在卵巢癌細胞中的表達情況,使用生物信息學預測工具發(fā)現ANRIL可能與miR-214有直接作用,兩者結合序列有相似的結合位置(圖2A)。為了驗證ANRIL能否與miR-214 3′UTR相結合,將ANRIL-siRNA與miR-214共轉染到293T細胞中。雙熒光素酶報告基因結果顯示(圖2B)：ANRIL-siRNA可以明顯抑制miR-214的熒光素酶活性。結果表明,ANRIL-siRNA能與miR-214的3′UTR特異性結合,并可以調控其表達活性與水平。

圖1 ANRIL和miR-214在卵巢癌細組織(A)及卵巢癌細胞株中的表達情況(B)Fig 1 ANRIL and miR-214 expression in ovarian cancer tissues (A) and ovarian cancer cell lines (B)*P<0.05 vs normal;△P<0.05 vs the other groups

2.4 lncRNA ANRIL對卵巢癌細胞株增殖能力的影響

克隆形成實驗結果顯示(圖3A),ANRIL-siRNA組細胞克隆形成數目明顯少于NC組[(0.82±0.09)×104vs(2.44±0.29)×104,P<0.05],差異具有統(tǒng)計學意義。MTT增殖實驗結果顯示(圖3B),ANRIL-siRNA實驗組的細胞增殖速率明顯低于NC組[3d(1.21±0.09)vs(1.85±0.21),P<0.05;4d(1.72±0.21)vs(3.28±0.30),P<0.05;5d(2.20±0.18)vs(3.98±0.29),P<0.05],兩組差異具有統(tǒng)計學意義,表明抑制ANRIL的表達后,卵巢癌SKOV3細胞的增殖能力得到一定的抑制。

2.5 lncRNA ANRIL對卵巢癌細胞株侵襲能力的影響

Transwell侵襲結果顯示(圖4),ANRIL-siRNA組通過Matrigel基質膠的細胞數量明顯少于NC組,[(65.82±7.98)vs(173.26±12.98),P<0.05],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明抑制ANRIL的表達后可以在一定程度上抑制卵巢癌SKOV3細胞的侵襲能力。

2.6 裸鼠成瘤實驗檢測lncRNA ANRIL對卵巢癌細胞株成瘤能力的影響

裸鼠體內成瘤實驗表明,抑制ANRIL后的卵巢癌SKOV3細胞在裸鼠體內成瘤能力明顯與對照組相比明顯減弱,6周后裸鼠腫瘤體積與對照組相比明顯減小[(2.83±0.42) cm3vs(0.51±0.16) cm3,P<0.05],6周后腫瘤質量與對照組相比明顯減小[(2.58±0.38) gvs(0.68±0.20) g,P<0.05]。差異有統(tǒng)計學意義(圖5),說明抑制ANRIL后卵巢癌SKOV3細胞在裸鼠體內成瘤能力相應減弱。

圖2 ANRIL和miR-214的結合位點(A)和雙熒光素酶檢測ANRIL和miR-214之間的相互關系(B)Fig 2 Binding sites for ANRIL and miR-214(A).Double luciferase detecting the correlation between ANRIL and miR-214(B)*P<0.05 vs NC

圖3 克隆形成實驗(A)和MTT細胞增殖實驗(B)檢測ANRIL對卵巢癌細胞增殖能力的影響Fig 3 Cloning formation assay(A) and MTT cell proliferation assay (B) detecting the effect of ANRIL on the proliferation of ovarian cancer cells△P<0.05 vs NC

圖4 Transwell侵襲實驗檢測ANRIL對卵巢癌細胞侵襲能力的影響Fig 4 Transwell invasion assay detecting the effect of ANRIL on invasive ability of ovarian cancer cells△P<0.05 vs NC

3 討論

近年來眾多研究表明并指出在多種類型的腫瘤中l(wèi)ncRNA的表達存在異常。lncRNA作為一種新型調控因子是目前腫瘤學領域研究的熱門方向。lncRNA是一類長度大于200個核苷酸分子,沒有蛋白質編碼

圖5 抑制ANRIL的表達對卵巢癌SKOV3細胞在裸鼠體內成瘤能力的影響Fig 5 Effect of inhibition of ANRIL expression on ovarian cancer SKOV3 cells in nude mice△P<0.05 vs NC

功能,不能進行常規(guī)的RNA轉錄。但是很多研究指出lncRNA可以與蛋白質相互作用,可以結合相應的蛋白起到調控作用[18]。有研究指出ANRIL與前列腺癌中的miR-146a表達水平呈負相關關系,可以通過誘導其啟動子中CpG島的甲基化來介導miR-146a的表達[19]。Lin等[20]學者研究指出,高表達的ANRIL與非小細胞肺癌患者的臨床分期,淋巴結轉移和遠處轉移的狀態(tài)有一定關系,可以作為非小細胞肺癌患者的預后檢測的生物標志物。本實驗結果顯示,ANRIL在卵巢癌組織中表達上調,ANRIL表達水平的卵巢患者與分化等級、病理分期及淋巴街轉移相關。此外,生物學功能實驗分析顯示,抑制ANRIL的表達后可以在一定程度上抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲行為。

本實驗除了檢測細胞學中ANRIL對卵巢癌細胞的相關作用,還進行裸鼠體外成瘤實驗檢測ANRIL的敲除在裸鼠體內的反應情況,確定ANRIL對卵巢癌細胞的綜合作用。之前也有相關研究表明lncRNA ANRIL可以通過與非小細胞肺癌細胞中的EZH2,LSD1蛋白結合進而抑制下游KLF2,P21和E-鈣黏蛋白的表達,參與非小細胞肺癌的生物學行為的調控[21]。同時lncRNA ANRIL可以通過結合EZH2抑制p15和p21蛋白的激活,促進胃癌細胞的細胞周期進程,加快胃癌細胞的生長和增殖[22]。在甲狀腺癌中,抑制ANRIL的表達可以降低miR-128的表達,進而調節(jié)甲狀腺激素受體(TSHR)的表達情況,參與甲狀腺癌細胞的生物學行為的調控[23]。本研究通過生物信息學網站預測顯示ANRIL與miR-214有一定的相似序列,ANRIL可能調控miR-214的表達后參與卵巢癌細胞的行為調控,后續(xù)的MTT細胞增殖實驗和Transwell侵襲實驗驗證了前面的推測。這與其他研究報道m(xù)iR-214可以作為部分惡性腫瘤細胞的腫瘤誘導因子的結論一致。Penna等[24]報道m(xù)iR-214可以通過靶向增加E2F3的表達促進人肝細胞癌細胞的增殖。而在最近的一項研究中,Wang等[25]指出miR-214可以聯合lncRNA減少宮頸癌細胞的上皮間質轉化進而影響宮頸癌的轉移過程。

總之,本研究發(fā)現ANRIL通過與miR-214相互作用調控卵巢癌SKOV3細胞增殖和侵襲行為,抑制其表達后，SKOV3細胞增殖和侵襲能力明顯減弱；ANRIL在卵巢癌組織中的表達水平明顯高于鄰近正常組織,表明其是通過影響卵巢癌細胞增殖侵襲起到促癌基因的作用。研究提示,ANRIL和miR-214可能通過影響卵巢癌細胞增殖侵襲過程干擾其進展,為卵巢癌的早期診斷和治療靶點提供一定的理論支持,為卵巢癌的治療和預后監(jiān)測提供幫助。