吳桂君，陳曉倩，劉永衡

（1.銀川能源學院 生物工程系，寧夏 永寧 750105；2.廣西中醫(yī)藥大學 研究生院，廣西 南寧 530001；3.寧夏工商職業(yè)技術學院 化工工程系，寧夏 銀川 750000）

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）、蛇龍珠（Cabernet Gernischt）和品麗珠（Cabernet Franc）屬于Carbernet系列品種，被稱為“三珠”，以其獨特的酒質成為世界著名釀酒品種[1-3]。蛇龍珠屬于歐亞類群，原產法國，是我國目前栽培面積最大的釀酒紅葡萄品種。我國的葡萄種植多集中于新疆、山東、寧夏、河北、遼寧、山西、吉林和河南等地。特別近十年葡萄栽培面積和產量一直呈上升趨勢。我國葡萄年產量約200萬t，栽培面積據(jù)世界第六位，產量據(jù)世界第五位，中國葡萄在世界已占有一席之地[4-6]。隨著葡萄酒產業(yè)在我國快速的發(fā)展，葡萄酒釀制過程中產生了大量的葡萄皮渣，其中主要是葡萄皮、葡萄籽和果梗等。目前這些皮渣主要被用作飼料、肥料，其綜合利用率較低，造成很大的浪費[7]。

果醋是一種營養(yǎng)豐富、風味優(yōu)良的酸味調味品，它兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能，最重要的是它可以以果渣為主要原料進行釀制，目前全國各地醋吧的興起，特別是在我國南方大中城市，食用果醋已成為一種時尚，在飲料中大有后來居上之勢[8]?？茖W研究發(fā)現(xiàn)，果醋具有多種功能，果醋能促進新陳代謝，調節(jié)酸堿平衡，消除疲勞，果醋中含有10種以上的有機酸和人體所需的多種氨基酸[9]。目前關于葡萄皮渣綜合利用的相關研究很多，如牛蕾等[10]對葡萄皮渣中的組成成分的研究，王占勇等[11]還研究了從葡萄皮中提取果膠等。本試驗以葡萄皮渣釀制的原酒為基礎，添加惡臭醋酸桿菌（A cetobactor rancens）渾濁變種AS1.41進行醋酸發(fā)酵試驗，探討接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉速、初始酒精含量對醋酸轉化率的影響，并設計了4因素4水平正交試驗，確定出最佳發(fā)酵條件和試驗方案，為后續(xù)新產品開發(fā)和品質分析提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蛇龍珠葡萄皮渣原酒：由蛇龍珠葡萄皮渣酒精發(fā)酵所得，酒精度7.6%vol。

惡臭醋酸桿菌（Acetobactor rancens）混濁變種AS1.41：上海北諾生物科技有限公司。

醋酸菌斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，CaCO31.5g，體積分數(shù)為95%乙醇2mL（滅菌后加入），瓊脂2g，水100mL。

醋酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，CaCO31.5g，體積分數(shù)為95%乙醇2 mL（滅菌后加入），水100 mL[12]。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）、NaOH（分析純）、CaCO3（分析純）、酚酞（指示劑）、酒石酸（分析純）、酵母膏（生化試劑）、瓊脂（生化試劑）、無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

pH320酸度計：上海雷磁電化學分析儀器公司；FUS-XL型10L發(fā)酵罐：上海國強生化裝備有限公司；DA-130N手持式數(shù)字酒精計：日本KEM生產；DHP-500W型電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HCQ-QX全溫振蕩器：常州華冠儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指標測定方法

酒精度的測定：蒸餾法和手持式數(shù)字酒精計[13]；總酸度的測定：酸堿中和滴定法[14]。

1.3.2 醋酸菌活化培養(yǎng)工藝

醋酸菌一級培養(yǎng)：在無菌狀態(tài)下，將選用的醋酸菌接入10 mL試管，30℃培養(yǎng)72 h為一代菌種。醋酸菌二級培養(yǎng)：在無菌狀態(tài)下，用無菌生理鹽水將生長良好的二代種子接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，500 mL三角瓶中裝液50 mL，接種量10%，在30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。瓶內有菌膜產生，培養(yǎng)基變渾濁，達到醋酸菌旺盛繁殖期即可。鏡檢后要求無雜菌。

1.3.3 醋酸發(fā)酵工藝流程

1.3.4 操作要點

（1）葡萄皮渣原酒：將5 kg葡萄皮渣放入發(fā)酵罐（20 L）中，添加蒸餾水不超過總容量的70%，將糖度調整為18%，滅菌（93～95℃，30 s）后接入0.6%的酵母菌，26～28℃酒精發(fā)酵6 d，酒精度為7.6%vol。

（2）醋酸發(fā)酵：將過濾后的原酒采用無水乙醇或蒸餾水調整至適合的酒精度，接入活化培養(yǎng)后的醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，以醋酸含量不再升高為終點。

（3）澄清殺菌：取上清液以0.45μm聚醚砜濾膜精濾；殺菌溫度60～70℃，時間10 min[15-16]。

1.3.5 醋酸轉化率的計算方法

式中：0.8為20℃時乙醇的密度，g/cm3；1.304為理論上醋酸與乙醇的質量比。

1.3.6 醋酸發(fā)酵工藝單因素試驗

將葡萄皮渣發(fā)酵釀制的葡萄酒采用無水乙醇或蒸餾水調整適宜的酒精度進行醋酸發(fā)酵。試驗采用液態(tài)振蕩發(fā)酵，發(fā)酵時間為10 d。分別以發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32 ℃、36 ℃），初始酒精度（6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol），醋酸菌接種量（6%、8%、10%、12%、14%）及搖床轉速（100 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）4個因素為考察對象，醋酸轉化率為指標，研究各因素對醋酸發(fā)酵的影響。

1.3.7 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

試驗方案采用4因素4水平正交試驗設計，在單因素醋酸發(fā)酵試驗基礎上，選取接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉速、初始酒精含量4個主要因素，以醋酸轉化率作為評價指標，利用DPS7.05軟件確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)，同時得出最優(yōu)試驗組合，采用最小顯著差數(shù)法進行顯著性分析，篩選出醋酸發(fā)酵工藝最優(yōu)組合，因素與水平編碼見表1。

表1 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件對葡萄皮渣醋酸發(fā)酵的影響

2.1.1 不同溫度對醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL酒精含量10%vol的果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃、30 s），然后接入活化后的醋酸菌種10%，放置在26℃、28℃、30℃、32℃、36℃全溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，轉速180 r/min，10 d內每天測定一次酸度和酒精度，計算出醋酸轉化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過程中合適的發(fā)酵溫度。其結果如圖1所示。

圖1 溫度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of temperature on acetic acid fermentation

由圖1可知，在26～36℃發(fā)酵溫度范圍內，隨著溫度上升，醋酸菌生長代謝較旺盛，醋酸轉化率穩(wěn)步提升。溫度在26℃時，雖然轉化率始終在提高，但是相對其他溫度時曲線偏低，當溫度在36℃時反而抑制了醋酸菌的活力，醋酸轉化率較低。因此，選取溫度28℃、30℃、32℃、34℃四個水平進行醋酸發(fā)酵正交試驗。

2.1.2 不同接種量對醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL酒精含量10%vol的果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃、30 s），然后分別以接種量6%、8%、10%、12%、14%接入活化后的醋酸菌種。30℃條件下全溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，轉速180 r/min，10 d內每天測定一次酸度和酒精度，計算出醋酸轉化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過程中合適的接種量，其結果如圖2所示。

圖2 接種量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

由圖2可知，接種量的多少對于醋酸發(fā)酵影響不大，只是接種量較大時在發(fā)酵初期，發(fā)酵速度較快，接種量較小時發(fā)酵速度較慢，轉化率也相應低一些，但是隨著發(fā)酵時間的延長，各接種量醋酸轉化率差距明顯變小，接種量在12%時醋酸轉化率最高。因此，選取接種量6%、8%、10%、12%四個水平進行醋酸發(fā)酵正交試驗。

2.1.3 不同初始酒精含量對醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃，30 s），然后分別接入活化后的醋酸菌種10%，調整初始酒精含量為6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol。30℃條件下全溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，轉速180 r/min，10 d內每天測定一次酸度和酒精度，計算出醋酸轉化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過程中合適的初始酒精含量，其結果如圖3所示。

初始酒精度越低，對醋酸菌抑制越小，在發(fā)酵初始階段，產酸較快。由圖3可知，當酒精度在9%vol和10%vol時，過高的酒精度抑制了醋酸菌的生長，醋酸轉化率在第5天以后增長幅度明顯變小，酒精度在6%vol～8%vol時，轉化率相對較高，由圖3可知初始酒精度7%vol發(fā)酵10天達到最大轉化率，但是從整個曲線圖的變化趨勢上觀察，酒精度在8%vol的時候，第5天以前轉化率提高速度較快，之后穩(wěn)定增長，第10天左右有所降低，這是由于發(fā)生過氧化作用，醋酸轉化率開始下降。因此，初始酒精度選取6%vol、7%vol、8%vol、9%vol四個水平進行醋酸發(fā)酵正交試驗。

圖3 初始酒精含量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial alcohol content on acetic acid fermentation

2.1.4 不同搖床轉速對醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL酒精含量10%vol的果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃、30 s），然后分別接入活化后的醋酸菌種10%，30℃條件下全溫搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，分別選取100 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min五個轉速進行醋酸發(fā)酵，10 d內每天測定一次酸度和酒精度，計算出醋酸轉化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過程中合適的搖床轉速，其結果如圖4所示。

圖4 搖床轉速對醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of rotating speed on acetic acid fermentation

醋酸菌發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，在氧化乙醇產生醋酸過程中需提高通氧量。由圖4可知，在較低的轉速100 r/min時，通氧量較低，發(fā)酵后期醋酸轉化率一直不高，當搖床轉速為200 r/min時，初期發(fā)酵旺盛，這是由于通氧量過高，醋酸菌大量生長繁殖，生長因子消耗過大，同時轉速過高加快了乙醇的揮發(fā)，所以在發(fā)酵后期曲線出現(xiàn)了下降的拐點，醋酸轉化率反而降低。因此，搖床轉速選取140 r/min、150r/min、160 r/min、170 r/min四個水平進行醋酸發(fā)酵正交試驗。

2.2 葡萄皮渣醋酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，選取溫度、初始酒精含量、接種量和搖床轉速為評價因素，醋酸轉化率為評價指標進行正交試驗設計，具體試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

從表2、表3可知，醋酸發(fā)酵的4個因素中，初始酒精含量是最主要影響因素，其次是發(fā)酵溫度，最后是搖床轉速和接種量。顯著性檢驗表明，發(fā)酵溫度、初始酒精含量、接種量、搖床轉速對醋酸轉化率的影響均為極顯著水平（P＜0.01），最優(yōu)的組合是A2B2C2D4，即溫度為30℃，初始酒精含量7%vol，醋酸菌接種量8%，搖床轉速170 r/min，在此條件下測得醋酸轉化率為92.26%。

2.3 討論

目前我國關于葡萄皮渣果醋報道很少，相關研究還處于起步階段，對于下一步果醋釀造還需要解決以下問題：葡萄皮渣釀造過程中醋酸菌選育優(yōu)化對產品品質有至關重要的作用，也是果醋產品品質產生差距的原因之一，但是由于時間和條件的限制未對菌種進行選育，今后可以采用物理誘變、化學誘變、原生質體融合等手段對此進行研究。同時本研究只針對寧夏本地釀酒葡萄品種皮渣釀制果醋做出了研究，并未涉及到區(qū)外其他地區(qū)葡萄品種的發(fā)酵研究，也未涉及到鮮食葡萄皮渣的發(fā)酵研究，故在今后的實踐過程中，將在本研究的基礎上，展開更加深入的探索。

3 結論

醋酸發(fā)酵階段初始酒精量、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉速都對醋酸轉化率有重要影響，其中通過單因素試驗確定了最適宜的工藝控制參數(shù)范圍，又通過4因素4水平正交試驗確定了最佳試驗組合方案，即：溫度30℃，初始酒精含量7%vol，醋酸菌接種量8%，搖床轉速170 r/min，此條件下醋酸轉化率為92.26%，其主要影響因素為初始酒精含量和發(fā)酵溫度。