王 勇，魏金旺*

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司 牛欄山酒廠(chǎng)，北京 101301）

牛欄山酒廠(chǎng)地處北京市順義區(qū)牛欄山鎮(zhèn)，在釀造二鍋頭的工藝過(guò)程中，一直保持著制曲、立茬、發(fā)酵等一系列工序。牛欄山二鍋頭以高粱為釀酒原料，采用清香型低溫大曲或麩曲為糖化發(fā)酵劑，低溫入缸（池）的清蒸清茬地缸發(fā)酵，清蒸二次清和瓷磚池發(fā)酵，混蒸續(xù)茬老五甑工藝，發(fā)酵期為21～30d[1-4]。在質(zhì)量上保持了傳統(tǒng)的清香純正、口味甘洌、酒體醇厚、酒力強(qiáng)勁的特點(diǎn)[5-6]，牛欄山二鍋頭酒作為我國(guó)清香型的典型代表性白酒之一，在國(guó)內(nèi)外也具有較高的知名度，逐漸成為北京的一種城市名片[7-9]。牛欄山二鍋頭獨(dú)特的風(fēng)味特征由上百種風(fēng)味物質(zhì)共同作用形成，王勇等[10-11]采用浸入式固相微萃取、液液萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)牛欄山二鍋頭的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性研究，并采用保留指數(shù)法對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，共獲得了101種香氣化合物的確切定性結(jié)果，其中包括35種酯類(lèi)、13種酸類(lèi)、15種醇類(lèi)、5種醛類(lèi)、1種酮類(lèi)、15種芳香族及酚類(lèi)、5種呋喃類(lèi)、2種吡嗪類(lèi)、3種縮醛類(lèi)、1種硫化物、6種其他類(lèi)化合物；采用氣相色譜-聞香-質(zhì)譜（gaschromatography-olfactorymass spectrometry，GC-O-MS）聯(lián)用儀方法解析了牛欄山二鍋頭中重要的香氣組分特征，采用液液萃取法提取牛欄山二鍋頭白酒中的香氣化合物，進(jìn)行聞香分析GC-O和GC-MS分離鑒定，一次性檢出92種香氣化合物，其中對(duì)牛欄山二鍋頭白酒整體香氣貢獻(xiàn)大的香氣成分有25種。但目前關(guān)于牛欄山二鍋頭中不揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究還很少有報(bào)道，“無(wú)酸不成味”，有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)是白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，白酒中有機(jī)酸的種類(lèi)和含量對(duì)白酒的風(fēng)味特征具有重要的影響，對(duì)白酒中有機(jī)酸種類(lèi)、含量和生成規(guī)律的分析研究對(duì)于評(píng)價(jià)酒體質(zhì)量、優(yōu)化釀造工藝具有重要意義。

目前，飲料酒中有機(jī)酸的分析方法主要有分光光度法、反向高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法、氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法、離子色譜（ion chromatography，IC）法等。其中離子色譜法因其靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單成為飲料酒中有機(jī)酸分析廣泛采用的方法。近年來(lái)，該方法開(kāi)始應(yīng)用于白酒中有機(jī)酸的分析檢測(cè)。劉瓊[12]選用濃香型白酒為樣品，進(jìn)行分析方法應(yīng)用的探討，并與氣相色譜分析方法作對(duì)比。離子色譜法分析白酒樣品中6～8個(gè)有機(jī)酸組分，只需約15 min，方法回收率98%～100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)在5%以下。卜宇宏[13]運(yùn)用離子交換分析方式加上抑制型電導(dǎo)檢測(cè)，作出白酒中有機(jī)酸的特征圖譜，結(jié)果表明乳酸、乙酸、丁酸、己酸的線(xiàn)性范圍分別為15～35 mg/L、25～45 mg/L、5～25 mg/L、30～50 mg/L，4種有機(jī)酸樣品加標(biāo)回收率為98%～103%，說(shuō)明該分析方法具有靈敏度高、分析速度快的特點(diǎn)。潘丙珍等[14]建立用離子色譜/電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定酒類(lèi)中有機(jī)酸和無(wú)機(jī)陰離子的分析方法，對(duì)11種有機(jī)酸和5種無(wú)機(jī)陰離子具有良好的線(xiàn)性，相關(guān)系數(shù)在0.990 9～0.9997；準(zhǔn)確度和精密度良好，樣品加標(biāo)回收率在81.0%～117.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandaral deviation，RSD）＜5.0%；檢出限低，在0.015～0.152mg/L。但是目前該方法還未見(jiàn)應(yīng)用于清香型白酒原酒中有機(jī)酸類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測(cè)。

本研究建立離子色譜法對(duì)清香型原酒中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)，并著重分析研究了牛欄山二鍋頭原酒中的有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)，探明有機(jī)酸在不同原酒中的分布規(guī)律，對(duì)研究濃香型、醬香型等原酒中的有機(jī)酸提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

牛欄山二鍋頭原酒：北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠(chǎng)。分別選取大茬和二茬酒頭、前段、中段、后段、尾段5個(gè)不同摘酒段，共十個(gè)酒樣。

1.1.2 化學(xué)試劑

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品（甲酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、丙酮酸鈉、乳酸鈉、琥珀酸鈉、草酸鈉、富馬酸鈉、檸檬酸鈉、異丁酸、異戊酸、2-乙基丁酸、戊酸、己酸、山梨酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、烏頭酸）：美國(guó)Sigma公司，母液均配制為1 000 mg/L，儲(chǔ)存于2～8℃。所用溶液均用電阻率為18.2 MΩ·cm超純水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000型離子色譜儀（配有EG40淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、電導(dǎo)檢測(cè)器和Chromeleon 6.80色譜工作站）、Ionpac AS11-HC型分離柱（250 mm×4 mm）、Ionpac AG11-HC型保護(hù)柱（50 mm×4 mm）、ASRS-ULTRA陰離子抑制器：美國(guó)Dionex公司；0.45μm過(guò)濾膜、Milli-QIQ 7000超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；HGC-12A氮吹儀：重慶中譜科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 離子色譜條件

色譜柱：Ionpac AS11-HC型分離柱（250 mm×4 mm），Ionpac AG11-HC型保護(hù)柱（50 mm×4 mm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：EG自動(dòng)產(chǎn)生淋洗液梯度淋洗，KOH梯度淋洗程序見(jiàn)表1；流速：1.0 mL/min；抑制器再生模式：外加水電抑制；電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)；進(jìn)樣量：25μL。首先選擇單一有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)，尋找其出峰時(shí)間及峰面積；其次選擇混合標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)。按照出峰時(shí)間進(jìn)行有機(jī)酸的定性，使用離子色譜自主選擇峰面積進(jìn)行有機(jī)酸的定量。

表1 白酒有機(jī)酸分析KOH梯度淋洗程序Table 1 KOH gradient eluting procedure of organic acid in Baijiu analysis

1.3.2 樣品前處理

將牛欄山二鍋頭酒樣稀釋50倍，過(guò)0.45μm過(guò)濾膜后直接進(jìn)樣，可直接定量濃度較高且保留時(shí)間靠前的部分有機(jī)酸（如乳酸、乙酸等）；將8 mL的酒樣在30℃條件下氮吹至1 mL，用超純水定容至2 mL，過(guò)0.45μm過(guò)濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)，即濃縮4倍進(jìn)樣檢測(cè)，可以定量濃度較低且保留時(shí)間靠后的有機(jī)酸（如二元酸等）。

按照上述樣品處理方式進(jìn)行離子色譜檢測(cè)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中有機(jī)酸含量，回收率是通過(guò)離子色譜檢測(cè)值與已知標(biāo)樣濃度的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒原酒中有機(jī)酸的檢測(cè)方法的建立

根據(jù)離子色譜的檢測(cè)，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、線(xiàn)性范圍、檢出限及回收率結(jié)果見(jiàn)表2，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖見(jiàn)圖1。

由表2可知，各有機(jī)酸測(cè)得的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上，加標(biāo)回收率除甲酸外（74.90%），在82%～118%之間。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)有機(jī)酸種類(lèi)多的特點(diǎn)，適合于清香型原酒中有機(jī)酸的分析檢測(cè)。

由圖1可知，該方法可在50 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)21種有機(jī)酸類(lèi)的完全分離，并且在保證各種有機(jī)酸都能出峰的基礎(chǔ)上，每個(gè)峰面都不重合，出峰時(shí)間能夠完全分離開(kāi)。因此，該檢測(cè)方法能有效地檢測(cè)清香型原酒中的有機(jī)酸，并且檢測(cè)有機(jī)酸種類(lèi)較多。

表2 21種有機(jī)酸離子色譜分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、線(xiàn)性范圍、檢出限和回收率Table 2 Standard curves regression equation,linear range,detection limits and recovery rates of 21 organic acids analyzed by ion chromatography

圖1 21種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜圖Fig.1 Ion chromatography of 21 mixed standard solutions of organic acids

2.2 牛欄山二鍋頭原酒中有機(jī)酸種類(lèi)及含量分析

采用1.3.2的處理原酒方法，對(duì)牛欄山二鍋頭原酒中有機(jī)酸種類(lèi)和含量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，在牛欄山原酒中共檢出9種有機(jī)酸，主要包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、己酸、丙酮酸。對(duì)不同原酒中有機(jī)酸定量分析發(fā)現(xiàn)，乙酸、乳酸是牛欄山原酒中的主要有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)，其中乙酸質(zhì)量濃度范圍為233.86～2416.98mg/L，占有機(jī)酸總含量的41.1%～79.3%；乳酸質(zhì)量濃度范圍為18.34～6504.96mg/L，占有機(jī)酸總含量的14.5%～57.5%；其他有機(jī)酸濃度較低，占有機(jī)酸總含量的1.3%～9.0%。乙酸和乳酸是牛欄山二鍋頭原酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，適量的乙酸和乳酸可賦予酒體酸爽感和協(xié)調(diào)感，平衡酒的苦味，提高酒的后味，同時(shí)有利于儲(chǔ)存過(guò)程中酒體老熟。

表3 牛欄山二鍋頭原酒中有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of organic acids contents in base liquor of Niulanshan Erguotou mg/L

2.3 牛欄山二鍋頭原酒中有機(jī)酸分布規(guī)律分析

清蒸二次清工藝可分為大茬酒和二茬酒，其中大茬酒采用純糧發(fā)酵，高粱經(jīng)過(guò)破碎、潤(rùn)料、蒸煮糊化、冷散、加曲后入缸發(fā)酵30 d，上甑分段掐酒得大茬酒；大茬蒸餾后的酒醅重新加水、冷散、加曲后二次入缸發(fā)酵30 d，上甑分段掐酒得二茬酒。從表3中可以看出，原酒中的有機(jī)酸中乙酸和乳酸含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，因此本研究著重對(duì)其兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了分析，乙酸變化分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同茬次原酒中乙酸含量比較Fig.2 Comparison of acetic acids contents in different batch of base liquor

由圖2可知，大茬酒和二茬酒在不同摘酒時(shí)間段乙酸含量的變化趨勢(shì)有差別，隨著摘酒時(shí)間的推移，大茬、二茬乙酸含量呈平緩上升曲線(xiàn)，乙酸在尾段含量最高。在牛欄山原酒酒頭中的乙酸為300 mg/L左右，而在后段、尾段則提高了3倍左右。原因可能是乙酸沸點(diǎn)較高（117.9℃），本身難蒸餾出，但酒中含有較多的醇、酯和醛類(lèi)物質(zhì)，乙酸與這些低沸點(diǎn)的化合物（乙醇為78.4℃）和水形成一定的共沸和拖帶作用，在一定程度上降低了乙酸的沸點(diǎn)，使得乙酸也能隨著溫度升高而逐漸餾出。

原酒中的乳酸變化分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同茬次原酒中乳酸含量比較Fig.3 Comparison of lactic acid contents in different batch of base liquor

由圖3可知，大茬乳酸幾乎呈線(xiàn)性遞增，尾段酒的酸增有一個(gè)突躍；二茬酒的乳酸增加呈平緩上升曲線(xiàn)。在牛欄山原酒中酒頭的乳酸為60 mg/L左右，而在后段、尾段則提高了5倍左右。這主要是因?yàn)殡y揮發(fā)酸在溫度較低的時(shí)候難以蒸餾出[15-16]，所以越是難揮發(fā)的物質(zhì)越是集中在溫度較高的后期餾出，這也解釋了隨著摘酒時(shí)間的推移，難揮發(fā)的乳酸增大的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本研究采用離子色譜技術(shù)建立了清香型白酒原酒中21種有機(jī)酸含量的分析方法。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，靈敏度高，所測(cè)樣品濃度在線(xiàn)性范圍之內(nèi)，適合于白酒原酒中有機(jī)酸的分析檢測(cè)。采用該方法系統(tǒng)分析了不同類(lèi)別牛欄山原酒中有機(jī)酸的種類(lèi)、含量和分布規(guī)律。在牛欄山原酒中共檢出9種有機(jī)酸，主體酸類(lèi)物質(zhì)為乙酸和乳酸。從定量結(jié)果來(lái)看，乙酸、乳酸質(zhì)量濃度在有機(jī)酸中屬于主要酸類(lèi)物質(zhì)，乙酸含量為233.86～2416.98mg/L，占有機(jī)酸總量的41.1%～79.3%；乳酸含量為18.34～6 504.96 mg/L，占有機(jī)酸總量的14.5%～57.5%；其他有機(jī)酸含量較低，占有機(jī)酸總量的1.3%～9.0%。

進(jìn)一步分析乙酸和乳酸在不同原酒中的分布規(guī)律發(fā)現(xiàn)，大茬酒和二茬酒在不同摘酒時(shí)間段乙酸含量的變化趨勢(shì)有差別，隨著摘酒時(shí)間的推移，乙酸大二茬含量呈平緩上升曲線(xiàn)。而大茬酒的乳酸幾乎呈線(xiàn)性遞增，尾段酒的酸增有一個(gè)突躍；二茬酒的乳酸增加呈平緩上升曲線(xiàn)，這主要是由乙酸和乳酸結(jié)構(gòu)決定的。