王艷艷 孫曉萱 張繆佳 王嬙（通訊作者）

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 江蘇 南京 210029）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一種慢性炎癥性疾病，炎癥細胞因子尤其是TNF-α在促發(fā)和維持RA的炎癥反應(yīng)中扮演決定性角色。RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)，TNF-α可通過自分泌和旁分泌途徑與靶組織上特異性受體結(jié)合，經(jīng)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活多種組織和炎性細胞，產(chǎn)生和分泌多種炎癥因子、黏附分子、生長因子、金屬蛋白酶、膠原酶等招募炎癥細胞的聚集和浸潤，促進滑膜血管增生、軟骨及骨損害[1]。對于RA的早期治療至關(guān)重要，抗TNF-α治療時機的選擇目前仍說法不一，本研究擬通過觀察膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型（CIA）不同病程血清及關(guān)節(jié)局部TNF-α水平表達的變化，為TNF-α抑制劑使用最佳時機尋求依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

實驗動物：Wistar大鼠，雄性，4～6周齡，30只，體重150±20g。主要試劑：牛源性Ⅱ型膠原蛋白及不完全弗氏佐劑，美國chondrex公司產(chǎn)品；過氧化物酶標記的羊抗大鼠抗體（chemicon公司）；札噴酸葡胺注射液(Gd-DTPA0.05mmol/ml)購自廣州先靈公司。主要儀器：足趾容積測量YLS-7B。

1.2 模型制備[2]

Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機分為兩組：實驗組15只，對照組15只。分別于第0d，7d以0.5mlⅡ型膠原乳劑（終濃度為1mg/ml），分3點真皮內(nèi)注射，對照組同部位注射0.05mol/L醋酸溶液0.5ml。

1.3 大鼠血清中TNF-α水平的檢測

在免疫大鼠第14d、21d以及42d，隨機抽取實驗組和對照組各5只，眼眶靜脈叢采血分離血清，-200C凍存，用ELISA方法檢測血清TNF-α水平。

1.4 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查及評分

第14d、21d以及42d，隨機抽取實驗組及對照組各5只大鼠，光鏡下觀察組織病理改變，同時進行關(guān)節(jié)病理評分。免疫組織化學(xué)方法染色雙足標本，分析TNF-α表達（陽性密度）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，正態(tài)分布且方差齊同的定量資料以均數(shù)±標準差表示，偏態(tài)分布資料以中位數(shù)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗或秩和檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 CIA模型

根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分及左足爪容積測定，大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平測定以及大鼠關(guān)節(jié)病理，CIA成模率93.33%。

2.2 CIA大鼠血清TNF-α水平

21d、42d大鼠血清TNF-α水平明顯增高（圖1）。

圖1 不同病程CIA大鼠血清中TNF-α表達水平

2.3 CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評分

在滑膜增生病理評分上21d和42d的大鼠與14d比較有差異（P＜0.05）；在新生血管病理評分上14d和42d的大鼠與21d比較有差異（P＜0.05）；炎癥細胞病理評分上14d、21d和42d無差異。（表1）

表1 不同病程CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評分

2.4 不同病程CIA大鼠關(guān)節(jié)TNF-a表達

在光鏡下觀察CIA大鼠14d關(guān)節(jié)滑膜表面襯里層細胞、軟骨細胞及皮膚鱗狀上皮細胞，TNF-α呈彌漫弱陽性；21d關(guān)節(jié)滑膜表面襯里層細胞、軟骨細胞、滑膜炎癥細胞、血管及皮膚鱗狀上皮細胞，TNF-α呈彌漫強陽性；42d關(guān)節(jié)軟骨細胞、滑膜炎癥細胞，TNF-α呈彌漫弱陽性。Metamorph圖像分析系統(tǒng)，隨機5個高倍視野，計算陽性面積比（陽性密度）。21d與14d、42d的關(guān)節(jié)局部TNF-α表達有顯著差異（P＜0.05）。（圖2A-C）

圖2 A 14d大鼠滑膜襯里層細胞TNF-α彌漫弱陽性

圖2 B 21d大鼠滑膜襯里層細胞、浸潤炎癥細胞、血管壁、軟骨TNF-α彌漫強陽性

圖2 C 42d大鼠滑膜襯里層細胞TNF-α彌漫弱陽性

3.討論

TNF-α在RA發(fā)病機制中的意義：（1）可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達黏附分子1，促進白細胞與血管內(nèi)皮黏附滲透導(dǎo)致局部炎癥；（2）增加滑膜、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞釋放生長因子促使血管翳的形成刺激基質(zhì)金屬蛋白酶表達；（3）刺激纖維母細胞和軟骨細胞產(chǎn)生地諾前列酮，促進軟骨損害和膠原降解。研究表明[3][4]多數(shù)RA患者血清中、關(guān)節(jié)液中TNF-α水平升高，TNF-α水平與RF、ESR和CRP呈正相關(guān)，與IFN-γ、IL-6變化趨勢一致。TNF-α在RA炎癥的形成、血管翳增生、軟骨和骨破壞中發(fā)揮重要病理作用，通過NF-κB途徑進一步活化細胞、體液免疫，促進趨化因子、細胞因子、粘附分子表達，形成自身炎癥反應(yīng)環(huán)，從而放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞。

本實驗通過病理觀察到CIA模型受累關(guān)節(jié)滑膜有大量炎性細胞浸潤，在大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥炎癥細胞病理評分上14d、21d和42d無差異，表明免疫初期直至成模炎癥反應(yīng)持續(xù)活躍狀態(tài)。21d血清中即可檢測到高水平TNF-α，免疫42d仍持續(xù)高濃度。CIA大鼠滑膜免疫組化染色結(jié)果顯示TNF-a陽性表達在14d時開始明顯增高，21d最強。局部滑膜表達TNF-α早于血清中TNF-α，考慮TNF-α主要是由滑膜巨噬細胞產(chǎn)生，初始主要存在于滑膜襯里細胞層[4]。TNF-α在不同病理時期高表達的部位不同，提示其對于RA的發(fā)病機制可能存在不同。

本實驗結(jié)合CIA模型不同病程的病理學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)CIA大鼠早期出現(xiàn)血清TNF-α水平增高及關(guān)節(jié)TNF-α表達陽性，且血清TNF-α持續(xù)高水平，在滑膜炎、血管翳增生等急性病理損傷期免疫組化TNF-α表達強陽性?；诳筎NF-α能減少RA患者滑膜TNF-α、IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白1、IL-1β、血管內(nèi)皮生長因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子表達，能減少白細胞向炎癥關(guān)節(jié)遷移，減少或阻止關(guān)節(jié)滑膜炎的發(fā)展和骨關(guān)節(jié)的破壞，改善關(guān)節(jié)炎癥狀，結(jié)合本實驗結(jié)果，在RA炎癥反應(yīng)初期，疾病早期使用TNF-α抑制劑可能療效更佳。