曾令達， 黃仲景， 廖建良， 尹 艷， 宋冠華， 鄭 倩

(惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007)

荔枝霜疫霉病是荔枝生產(chǎn)和果實貯藏中最主要的一種病害，會給產(chǎn)量和果品貯藏帶來極大的損失[1-2]，其病原為荔枝霜疫霉[3]。南方夏季荔枝果實發(fā)育期及采收期正值高溫多雨季節(jié)，荔枝果實極易受荔枝霜疫霉的侵染，造成果實腐爛變質(zhì)。荔枝霜疫霉病在果園管理中仍以安克錳鋅、瑞毒霉錳鋅等化學(xué)藥劑防治為主[4-5]，在荔枝生產(chǎn)中使用化學(xué)藥劑容易造成荔枝霜疫霉抗藥性提高，頻繁用藥又易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留，存在安全隱患。因此，研究和開發(fā)植物活性物質(zhì)防治荔枝霜疫霉病對環(huán)境和果品安全，對促進荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。目前，已研究發(fā)現(xiàn)一些植物的提取物對荔枝霜疫霉具有較強的抑制活性[6]。宋冠華等發(fā)現(xiàn)，白鮮、虎杖、蛇床等植物的乙醇提取物對荔枝霜疫霉有較強的抑制效果[7]。吳光旭等發(fā)現(xiàn)，開口箭中的1β，2β，3β，4β，5β，7α-六羥基螺甾-25(27)-烯-6-酮和螺甾-25(27)-烯-1β，2β，3β，4β，5β，6β，7α-七醇具有抗荔枝霜疫霉菌活性[8]。胡珊等研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚、香芹酚、檸檬醛、肉桂醛等均對荔枝霜疫霉有抑制作用[9]。曾令達等發(fā)現(xiàn)，苦參提取物對荔枝霜疫霉具有較強的抑制作用[10]，但目前關(guān)于花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)油中的檸檬烯、桉樹腦、月桂烯等3種主要活性物質(zhì)對荔枝霜疫霉的抑菌效果和差異的研究未見報道。因此，本試驗在離體培養(yǎng)條件下，運用菌絲生長法測定3種物質(zhì)的抑菌活性，進一步探索植物提取物具有抑菌活性的原因，同時研究不同抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力差異，以及活性物質(zhì)復(fù)配對荔枝霜疫霉的抑制作用，以期為探尋新型的植物源抑菌活性物質(zhì)用于荔枝霜疫霉病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

供試菌種為荔枝霜疫霉菌(PeronophythoralitchiChen.)，由惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)實驗室提供。供試檸檬烯(純度≥97%)、桉樹腦(純度≥99%)、月桂烯(純度≥90%)、苦參堿(純度≥98%)等，均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。吐溫-80(分析純)，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 抑菌活性測定

1.2.1 單一活性物質(zhì)的抑菌活性測定 在培養(yǎng)皿中倒入經(jīng)高溫高壓滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡稱PDA)培養(yǎng)基[200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL 自來水，pH值自然]，制成平板后接種荔枝霜疫霉菌。于28 ℃培養(yǎng)7 d后荔枝霜疫霉菌菌種培養(yǎng)完成，用無菌打孔器沿著菌種菌落邊緣打取直徑為4 mm的菌餅。將檸檬烯和桉樹腦純品預(yù)先稀釋成濃度為0.20 mg/mL的母液(加入適量的吐溫-80作為分散劑)，將月桂烯純品制成濃度為 25.00 mg/mL 的母液，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾膜過濾后攝取適量的母液與已滅菌尚未凝固的PDA培養(yǎng)基混合，得到一定濃度含活性物質(zhì)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基凝固后，用已滅菌的鑷子將菌餅移接到含藥培養(yǎng)基中央，將培養(yǎng)皿倒置，在28 ℃條件下進行恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測量并記錄菌落直徑，同時以只添加吐溫-80的培養(yǎng)基作為空白對照，每個處理重復(fù)5次。

抑菌率計算公式：抑菌率=(對照菌落凈生長量-處理菌落凈生長量)/對照菌落凈生長量×100%。按抑菌率大小查生物統(tǒng)計概率值換算表，將抑菌率換算成相應(yīng)的概率值，質(zhì)量濃度用其對數(shù)值表示，以各抑菌劑濃度的對數(shù)值(X)和抑菌率的概率值(Y)求毒力回歸方程Y=a+bX，并計算抑菌中濃度(EC50)。

1.2.2 活性物質(zhì)復(fù)配物的抑菌活性測定及其增效比的計算 將檸檬烯和苦參堿預(yù)先稀釋成濃度為0.1 mg/mL的母液(加入適量吐溫-80作為分散劑)，攝取適量苦參堿、檸檬烯母液按1 ∶1(體積比)配制一定濃度的含活性物質(zhì)的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)、菌落測定及EC50的計算同“1.2.1”節(jié)。

參照農(nóng)藥組合物協(xié)同增效作用判斷方法[11]計算增效比?；钚晕镔|(zhì)復(fù)配物的理論EC50計算公式為復(fù)配物理論EC50=(a+b)/[(a/A的EC50)+(b/B的EC50)]，式中，A、B分別代表不同植物提取物，a、b分別為2種提取物在混劑中含量的占比。以增效比(synergic ratio，簡稱SR)判定不同混合組配的抑菌物質(zhì)的抑菌作用是否具有增效作用，SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。SR計算公式為SR=EC50理論值/EC50實測值。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS 19.0進行統(tǒng)計的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表1可知，檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的抑制率隨著檸檬烯濃度的增加而變大。當(dāng)檸檬烯濃度為2.0 mg/L時，抑菌率為11.5%，當(dāng)檸檬烯濃度為16.0 mg/L時，抑菌率為89.8%，當(dāng)檸檬烯濃度達到32.0 mg/L時，抑菌率達到100.0%，說明此時檸檬烯對荔枝霜疫霉菌菌絲生長具有完全的抑制作用。根據(jù)抑菌率和檸檬烯的濃度計算出檸檬烯的毒力方程為Y=3.680 8X+2.385 1，r2=0.911，從毒力方程得出檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的EC50為7.2 mg/L。

2.2 桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表2可知，當(dāng)桉樹腦濃度為2.5 mg/L時，抑菌率為20.5%，而當(dāng)桉樹腦濃度為20.0 mg/L時，抑菌率達到了 86.7%，當(dāng)桉樹腦濃度為40.0 mg/L時，抑菌率為100.0%。隨著桉樹腦濃度的增加，對荔枝霜疫霉菌的抑制作用隨之增大，當(dāng)桉樹腦濃度為40.0 mg/L時，對荔枝霜疫霉菌的生長具有完全的抑制用。根據(jù)抑菌率和桉樹腦的濃度計算出桉樹腦的毒力方程為Y=3.530 8X+2.118 1，r2=0.993，從毒力方程得出桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的EC50為6.5 mg/L。

表1 不同濃度檸檬烯對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

表2 不同濃度桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

2.3 月桂烯對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表3可知，當(dāng)月桂烯的濃度為25.0 mg/L時，對荔枝霜疫霉的抑菌率為17.3%，當(dāng)月桂烯的濃度為50.0 mg/L時，抑菌率為25.5%，說明月桂烯對荔枝霜疫霉菌有抑菌活性，但月桂烯的濃度增加了1倍，抑菌率才增加8.2%，說明月桂烯的抑菌效果較低。在月桂烯的處理濃度較大時，抑菌率有所增加，當(dāng)月桂烯的濃度為200.0 mg/L時，抑菌率為 74.3%，而當(dāng)月桂烯的濃度為400.0 mg/L時，抑菌率僅為88.2%。從月桂烯的不同處理來看，月桂烯對荔枝霜疫霉菌的抑菌率隨著處理濃度的增加而加大，說明月桂烯對荔枝霜疫霉菌具有抑菌活性，但在較高處理濃度時，抑菌率未達100%。根據(jù)抑菌率和月桂烯的濃度可以計算出月桂烯的毒力方程為Y=1.727 6X+1.566 1，r2=0.976，從毒力方程得出月桂烯對荔枝霜疫霉菌的EC50為97.2 mg/L。

表3 不同濃度月桂烯對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

2.4 苦參堿+檸檬烯復(fù)配劑對荔枝霜疫霉菌的抑制活性

由表4可知，當(dāng)復(fù)配物濃度為2.0 mg/L時，抑菌率為 8.7%，當(dāng)復(fù)配劑的濃度提高時，抑菌率增加，當(dāng)復(fù)配物濃度為32.0 mg/L時，抑菌率達到95.7%。將復(fù)配劑的濃度和抑菌率進行回歸分析，得到復(fù)配劑的毒力回歸方程為Y=2.597 6X+2.540 1，r2=0.953，EC50實測值為8.9 mg/L。通過計算復(fù)配劑的EC50理論值為16.4 mg/L，增效比為1.8，苦參堿與檸檬烯的復(fù)配作用表現(xiàn)為增效作用。

表4 苦參堿+檸檬烯復(fù)配劑對荔枝霜疫霉菌的抑制效果

注：苦參堿對荔枝霜疫霉菌的EC50為105.0 mg/L，數(shù)據(jù)暫未發(fā)表。

3 討論與結(jié)論

花椒是一種重要的食用調(diào)味品、中藥材、香料及木本油料樹種，屬蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)[12]。張懷予等分析發(fā)現(xiàn)，花椒油中成分共有73種化學(xué)物質(zhì)，以萜烯、醇、酯類物質(zhì)為主，檸檬烯、桉樹腦、月桂烯的含量分別為 20.204%、5.049%、4.937%，這3種物質(zhì)為花椒油的主要成分[13]。袁娟麗等發(fā)現(xiàn)，花椒揮發(fā)油主要化合物成份鑒定出的物質(zhì)中有5種物質(zhì)的相對含量超過60%，其中桉樹腦占 15.64%、D-檸檬油精占13.72%、β-月桂烯占10.20%[14]。不同產(chǎn)地的花椒油成分不太一樣，花椒果皮揮發(fā)油相對含量在3%以上，成分各有不同，但主要以單菇類物質(zhì)為主，但共有的成分有檸檬烯、月桂烯、按樹腦等[15]。花椒油對真菌有抑制作用，是天然的抑菌植物源物質(zhì)[16]。唐裕芳等發(fā)現(xiàn)，花椒油含有的桉樹油、其酯類、β-月桂烯、檸檬烯等成分有協(xié)同作用，具有一定的抑菌能力[17]。花椒油乙醇提取物對荔枝霜疫霉菌具有較好的抑制作用[10]。高紅亮等發(fā)現(xiàn)，檸檬烯在橙汁保鮮中具有較好的保鮮效果[18]。檸檬烯是安全無毒、應(yīng)用廣泛的防腐劑，且具有廣譜的抗菌性[19]。孟雪等發(fā)現(xiàn)，桉樹腦對5種真菌具有一定的抑制作用[20]。郭阿君發(fā)現(xiàn)，月桂烯對枯草芽孢桿菌有抑制作用[21]。本試驗中檸檬烯、桉樹腦、月桂烯等3種物質(zhì)對荔枝霜疫霉菌均表現(xiàn)出抑制作用，3種活性物質(zhì)中桉樹腦對荔枝霜疫霉菌的EC50最低，為 6.5 mg/L，其次為檸檬烯，為7.2 mg/L，月桂烯的最高，為 97.2 mg/L。

苦參堿屬于四環(huán)喹嗪啶類化合物，是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科中草藥的活性物質(zhì)，分子式為C15H24N2O，相對分子質(zhì)量為266[22-24]?？鄥A對多種真菌具有抑菌活性[25-26]。曾令達等用乙醇提取花椒和苦參的抑菌活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)苦參和花椒的粗提物按1 ∶1(體積比)復(fù)配對抑制荔枝霜疫霉菌具有增效作用[27]。本試驗中以花椒中的活性物質(zhì)檸檬烯與苦參堿按1 ∶1(體積比)進行復(fù)配，在對荔枝霜疫霉菌的抑制試驗中增效比為1.8，兩者復(fù)配具有增效作用。因此，從本試驗的結(jié)果來看，可以從花椒中提取活性物質(zhì)用于荔枝霜疫霉病的防治，為增加抑菌效果，可以選擇與其他植物的活性物質(zhì)進行復(fù)配。