劉海霞，溫灝宇，楊波，李曉慧，張鵬飛,3，溫鵬飛,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.果樹(shù)種質(zhì)創(chuàng)制和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

原花色素(PAs)，以黃烷-3-醇的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，是一類(lèi)以低分子量單體或高聚合度的聚合體形式存在的無(wú)色酚類(lèi)化合物[1]，是類(lèi)黃酮生物合成途徑一個(gè)分支的末端產(chǎn)物，對(duì)葡萄果實(shí)和葡萄酒的顏色、風(fēng)味、收斂性以及苦味的形成起著重要的作用。前人研究表明，PAs合成涉及類(lèi)黃酮生物合成途徑的一系列酶促反應(yīng)[2]，其中二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)是原花色素合成的關(guān)鍵酶之一，以二氫櫟皮黃酮(DHQ)、二氫堪非醇(DHK)和二氫楊梅黃酮(DHM)為底物催化生成原花色素單體黃烷-3-醇，后經(jīng)聚合而形成原花色素。MYB轉(zhuǎn)錄因子參與植物的次生代謝(如黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成[3])、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、器官形態(tài)建成以及激素和逆境因子應(yīng)答等過(guò)程[4]。目前，已經(jīng)證實(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子(如MybPA1)通過(guò)控制原花色素生物合成過(guò)程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)，從而調(diào)控原花色素的生物合成[5，6]。但MybPA1與原花色素合成關(guān)鍵酶DFR的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，酵母雙雜交是用來(lái)研究蛋白與蛋白之間相互作用的有效方法，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒是酵母雙雜交的基礎(chǔ)[7]。為了進(jìn)一步明確DFR蛋白的作用和功能，本研究對(duì)DFR的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建了DFR基因的酵母雙雜交誘餌載體，同時(shí)檢驗(yàn)其DFR蛋白的自激活活性，以期通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)來(lái)研究與DFR有互作反應(yīng)的蛋白，從而為原花青素等酚類(lèi)物質(zhì)的生物合成及調(diào)控機(jī)制研究奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酵母菌AH109、表達(dá)載體pGBKT7購(gòu)于Clontech公司，限制性內(nèi)切酶EcoRI、SacI、T4-DNA連接酶、DNA marker、克隆載體pMD19-T購(gòu)于TaKaRa公司。提取質(zhì)粒和回收膠試劑盒購(gòu)于Omega公司，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、高保真酶定購(gòu)于全式金生物技術(shù)公司。所有的測(cè)序及引物合成都來(lái)源于華大有限公司。

1.2 葡萄DFR蛋白生物信息學(xué)分析

利用在線軟件InterProScan程序檢索EBI的InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測(cè)DFR蛋白序列上潛在的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上保守區(qū)域CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析了DFR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/wrpsb.cgi)。在線軟件STRING(http://string-db.org/cgi/input.pl)對(duì)DFR蛋白互作進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 DFR基因片段引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

1.4 誘餌載體pGBKT7-DFR的構(gòu)建與檢測(cè)

將DFR擴(kuò)增回收產(chǎn)物在16 ℃下與克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接反應(yīng)45 min，然后在冰浴條件下轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，成功獲得克隆載體pMD-DFR。提取pMD-DFR質(zhì)粒，用內(nèi)切酶SacI和EcoRI雙酶切pMD-DFR和空載體pGBKT7質(zhì)粒，割膠回收所切出的目的片段，然后在16 ℃下與T4-DNA連接酶連接反應(yīng)10 h，再迅速轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，篩選出陽(yáng)性菌珠后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將PCR驗(yàn)證后的菌液過(guò)夜揺菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-DFR的自激活活性檢測(cè)

將1.2 μg誘餌質(zhì)粒pGBKT7-DFR中加入10 μL pGADT7空質(zhì)粒和10 μL預(yù)變性的鮭魚(yú)精DNA(沸水浴5 min，冰浴2 min，重復(fù)3 次)在預(yù)冷的1.5 mL離心管中混勻，加入200 μL的酵母菌感受態(tài)細(xì)胞AH109后迅速進(jìn)行渦旋震蕩。最后再加入650 μL過(guò)夜滅菌后的PEG/LiAc立刻漩渦震蕩25 s，置于搖床中在30 ℃，220 r·min-1下培養(yǎng)1 h。然后加入80 μLDMSO后緩慢上下顛倒混勻，42 ℃下水浴12 min后迅速冰浴4 min，在室溫條件下，10 000 r·min-1，離心45 s后將上清液迅速倒掉，向沉淀中加入300 μL滅菌后的雙蒸水進(jìn)行渦旋混勻，共轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞AH109中，作為試驗(yàn)組。同時(shí)以共轉(zhuǎn)化pGBKT7與pGADT7空質(zhì)粒作為空載體對(duì)照，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-lam與pGADT7-T作為陰性對(duì)照，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53與pGADT7-T作為陽(yáng)性對(duì)照。30 ℃恒溫下，分別將空載體組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、試驗(yàn)組的轉(zhuǎn)化液涂在缺陷型SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade板上和含有X-α-Gal的SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d，然后觀察菌落的顏色變化。

1.6 pGBKT7-DFR誘餌載體的毒性檢測(cè)

將轉(zhuǎn)化酵母AH109的pGBKT7和pGBKT7-DFR陽(yáng)性克隆菌液分別涂布于SD/-Trp營(yíng)養(yǎng)選擇性固體培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d，待長(zhǎng)出菌落后，分別隨機(jī)挑取5 個(gè)單菌落于SD/-Trp營(yíng)養(yǎng)選擇性液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r·min-1恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)培養(yǎng)物的OD600值，如果OD600≥0.8，則誘餌載體無(wú)毒性，如果OD600<0.8，則誘餌載體對(duì)酵母菌有毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DFR蛋白功能域的分析

通過(guò)在線InterProScan軟件中檢索的EBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析，結(jié)果表明，DFR蛋白具有NAD依賴型的差向異構(gòu)酶、脫氫酶N端結(jié)構(gòu)區(qū)域(NAD-dependent epimerase/dehydratase,N-terminal domain)和NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。利用NCBI中Blast在線檢索的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)DFR蛋白具有NADB-Rossmann保守結(jié)構(gòu)域，屬于黃酮還原酶家族成員，擁有NADP、活性和底物的結(jié)合位點(diǎn)和獨(dú)特的AR-like-SDR-e元件，具備了還原酶的特征結(jié)構(gòu)序列(圖2)。

圖1 DFR功能位點(diǎn)分析Fig.1 Functional sites of DFR

圖2 DFR蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domains of DFR protein

2.2 DFR蛋白互作預(yù)測(cè)

利用STRING在線軟件對(duì)DFR蛋白與MybPA1蛋白互作情況進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，圖3中的互作網(wǎng)絡(luò)顯示DFR蛋白與MybPA1蛋白存在互作關(guān)系，同時(shí)DFR與原花色素生物合成相關(guān)酶基因(F3’5’H、ANR、LODX、F3H、LAR)也存在互作關(guān)系。

圖3 DFR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)Fig.3 DFR protein interaction network prediction

2.3 DFR基因PCR擴(kuò)增

菌液PCR擴(kuò)增后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)1 條大小約為1 014 bp片段(圖4)，和預(yù)期結(jié)果相同。

圖4 DFR基因片段PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR product of DFR gene fragmentM:2000 DNA marker;1～3:菌液PCR產(chǎn)物M:2000 DNA marker;1-3:PCR product of bacterial solution

2.4 pMD-DFR克隆載體的構(gòu)建及鑒定

將切膠回收后的DFR產(chǎn)物在16 ℃下與克隆載體pMD19-T反應(yīng)45 min，快速轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)待長(zhǎng)出大量菌落時(shí)，挑取飽滿的單菌落進(jìn)行菌液PCR陽(yáng)性篩選與鑒定，可見(jiàn)到與預(yù)期相一致的目的片段(圖5)，測(cè)序驗(yàn)證為目的基因，且無(wú)堿基突變，成功構(gòu)建了克隆載體pMD-DFR。

圖5 菌液PCR鑒定Fig.5 Identification of bacteria by PCRM:2000 DNA maker;1～4:菌液PCR產(chǎn)物M:2000 DNA Marker;1-4:PCR productof bacterial solution

2.5 pGBKT7-DFR誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將空質(zhì)粒pGBKT7和成功構(gòu)建的克隆載體pMD-DFR用EcoRI和SacI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切回收目的片段并用T4-DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到單克隆轉(zhuǎn)化子菌株1和2，采用PCR與雙酶切均檢測(cè)到質(zhì)粒中插入一段與目的基因大小相當(dāng)?shù)钠?圖6)，表明誘餌載體pGBKT7-DFR構(gòu)建成功。

圖6 pGBKT7-DFR誘餌載體PCR和雙酶切鑒定Fig.6 Detection of bait vector pGBKT7-DFR with PCR and double enzyme digestion注：A:pGBKT7-DFR誘餌質(zhì)粒PCR驗(yàn)證；M:2000 DNA ladder；1～2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B:pGBKT7-DFR誘餌質(zhì)粒的雙酶切鑒定；M:2000 DNA ladder；1和2:雙酶切結(jié)果Note:A:Bait vector pGBKT7-DFR PCR identification;M:2000 DNA ladder;1-2: PCR amplification products;B:Detection of bait vector pGBKT7-DFR by doub le enzyme;M:2000 DNA ladder;1-2:results of double enzyme

2.6 pGBKT7-DFR誘餌載體的毒性和自激活檢測(cè)

分別挑取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGBKT7和pGBKT7-DFR的酵母菌AH109于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 rpm下振蕩培養(yǎng)24 h，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)為600時(shí)培養(yǎng)物的OD值。由表1可見(jiàn)，兩者菌液的OD600值都大于0.8，說(shuō)明誘餌載體pGBKT7-DFR對(duì)AH109沒(méi)有毒性作用。分別吸取160 μL空載體對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、試驗(yàn)組的菌液于含有顯色劑X-α-Gal的SD/-Trp/-Leu與SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade板上，放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，2 d后發(fā)現(xiàn)只有陽(yáng)性對(duì)照組長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，而其他組在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal板上長(zhǎng)出白色的菌落，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal板上無(wú)菌落生長(zhǎng)(如圖7)，表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-DFR無(wú)法激活A(yù)H109酵母菌中指示基因MEL1的表達(dá)(MELI編碼α-半乳糖苷酶，隨著顯色劑X-α-Gal的出現(xiàn)陽(yáng)性菌落就會(huì)由白色變成藍(lán)色)，因此證實(shí)了pGBKT7-DFR誘餌蛋白沒(méi)有自激活活性。

3 討論與結(jié)論

二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)擁有特定的NADPH結(jié)合域[8]。DFR基因編碼的蛋白具有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)，在NADPH存在的環(huán)境中，DFR可以特異性的把二氫黃酮醇催化成黃烷-3,4-二醇(即隱色花色素)，是類(lèi)黃酮代謝中原花色素合成的關(guān)鍵酶之一。自1985年首次從玉米和金魚(yú)草中分離以來(lái)，DFR基因先后從矮牽牛、擬南芥[9]、油菜、水稻、馬鈴薯、非洲菊、玫瑰、玉米[10，11]等草本植物，以及甜櫻桃[12]、石榴、山葡萄、獼猴桃[13]、山竹子、荔枝[14]等果樹(shù)中得到了克隆。

表1 誘餌質(zhì)粒的OD600值Table 1 The OD600 value of bait plasmid

圖7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞自激活活性檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of self-activation activity of yeast AH109 cells transformed by recombinant plasmid

DFR基因廣泛分布于各植物的不同組織中，有研究發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)于枸杞不同的組織中，如根、莖、葉等。除了影響著原花色素的生物合成，還在單寧、花色苷等酚類(lèi)物質(zhì)的合成途徑中起著重要作用[15]。潘麗晶等[16]發(fā)現(xiàn)：石斛蘭的花中明顯缺少藍(lán)色和黃色，這種現(xiàn)象與DFR的活性有著不可分割的關(guān)聯(lián)。有研究證實(shí)，在赤霞珠葡萄果實(shí)中，DFR的活性和基因表達(dá)水平直接影響著葡萄果實(shí)原花色素的生物合成[17]，在原花色素合成途徑中起著至關(guān)重要的作用[18，19]。本課題組前期研究結(jié)果表明：DFR和MybPA1在葡萄的不同時(shí)期都有表達(dá)，MybPA1及其MybPA1蛋白的表達(dá)與DFR基因呈負(fù)相關(guān)[20]。王曉平等人[21]的研究表明，京亞葡萄中的MybPA1、MybPA2與原花色素的形成有關(guān)，Bogs等人[6]研究MybPA1對(duì)西拉葡萄中的原花色素的生物合成調(diào)節(jié)有特效。由于MYB 轉(zhuǎn)錄因子往往是通過(guò)調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)而影響原花色素合成[22]，所以推測(cè)MybPA1可能是通過(guò)調(diào)節(jié)DFR的表達(dá)從而調(diào)控原花色素的合成。同時(shí)從在線軟件STRING網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)圖中得出，MybPA1蛋白與DFR蛋白存在互作關(guān)系，但是互作機(jī)制還未明確需要更深一步的研究。

酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白與蛋白互作的一種有效方式，此技術(shù)不僅用于研究已知蛋白間的相互作用，在篩選與誘餌蛋白互作的未知蛋白方面也起著關(guān)鍵作用[23]。構(gòu)建誘餌表達(dá)載體是利用酵母雙雜交系統(tǒng)大量篩選互作蛋白的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析得出，DFR蛋白屬于黃酮還原酶家族成員，擁有NADB-Rossmann保守結(jié)構(gòu)域和NADP結(jié)合位點(diǎn)，具有還原酶的典型特征；從預(yù)測(cè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中得出，DFR蛋白與MybPA1蛋白存在互作關(guān)系。成功構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-DFR，細(xì)胞生長(zhǎng)分析顯示DFR對(duì)酵母菌AH109無(wú)細(xì)胞毒性，通過(guò)檢測(cè)AH109中報(bào)告基因MEL1的活性，證明誘餌載體pGBKT7-DFR對(duì)酵母菌AH109無(wú)自激活，該誘餌載體可用于篩選酵母雙雜交系統(tǒng)中與DFR互作的蛋白，從而為深入研究DFR的功能奠定了重要基礎(chǔ)。