周雅莉，安茜，任文燕，李璐，趙靜，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

紫蘇(Perillafrutescens(L.) Britt.)，是唇形科紫蘇屬一年生草本植物[1]，主要分布在中國、尼泊爾、韓國和越南等東南亞國家，且中國已有2000多年的栽培歷史[2]。紫蘇作為一種多用途的經(jīng)濟(jì)作物，是衛(wèi)生部首批頒布的既是藥品又是食品的60種“藥食同源”作物之一[3]，近年來倍受國內(nèi)外關(guān)注。紫蘇籽出油率高達(dá)45%～55%，不飽和脂肪酸含量豐富，占總含油量的90%以上，其中以人體必需脂肪酸(α-亞麻酸)含量最高，可作為食用油中不飽和脂肪酸的重要來源[4]。

三酰甘油(triacylglycerol, TAG)是紫蘇等油料作物種子油的重要組成成分，在種子發(fā)育過程中大量積累。通常人們認(rèn)為植物種子油脂合成過程中TAG的合成有兩種途徑：一種是依賴脂酰-CoA的Kennedy途徑[5]；另一種是不依賴于脂酰-CoA的合成途徑(即PDAT途徑)。磷脂：二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)是催化TAG合成最后一步?；磻?yīng)的關(guān)鍵酶，該酶以磷脂為?；w，以二酰甘油(DAG)為受體，將磷脂酰膽堿Sn-2位的?；D(zhuǎn)移到DAG 的Sn-3位上，產(chǎn)生TAG和溶血磷脂酰膽堿[6，7]。PDAT途徑最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母，且被認(rèn)為是酵母對(duì)數(shù)生長時(shí)TAG合成的主要途徑[7]。已有研究表明，PDAT基因是調(diào)節(jié)植物種子油脂合成積累的關(guān)鍵酶基因[5～8]，該基因催化形成的TAG中，Sn-3位多為不飽和脂肪酸，尤其是亞麻酸[9]，不飽和脂肪酸的含量與植物抗逆性密切相關(guān)，那么PDAT基因除了調(diào)控植物種子油脂代謝之外，是否參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，目前研究甚少。本試驗(yàn)從紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得PDAT1基因全長cDNA序列，分析其序列特征及編碼蛋白結(jié)構(gòu)，并對(duì)紫蘇不同組織及干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫下該基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，為深入研究PDAT基因在紫蘇生長發(fā)育過程中的重要作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫蘇品種為山西省農(nóng)科院棉花研究所提供的‘晉蘇1號(hào)’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理

篩選籽粒飽滿的‘晉蘇1號(hào)’種子置于滅菌后的10 mL離心管中，先用蒸餾水沖洗，然后加入0.01% 的升汞消毒8 min，無菌水洗滌3～5次，將種子播種于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱(25 ℃)中培養(yǎng)。待紫蘇種子長出側(cè)根后轉(zhuǎn)至1/2 MS液體培養(yǎng)基中，幼苗第4片真葉長出后選取長勢較為一致且生長健壯的幼苗進(jìn)行逆境脅迫處理，每5株幼苗作為一組處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，以不作脅迫處理的幼苗作為對(duì)照。

根據(jù)李璐[6]研究結(jié)果表明，PEG、NaCl脅迫處理6 h 時(shí)紫蘇幼苗抗逆性狀有明顯差異，所以本試驗(yàn)選擇 6 h 作為最佳處理時(shí)間。PEG模擬干旱處理：將幼苗根部分別在15%、20%和25%的PEG6000溶液中浸泡6 h；NaCl處理：將紫蘇幼苗根部分別在50 mmol·L-1、100 mmol·L-1和150 mmol·L-1的NaCl溶液中浸泡6 h；低溫處理：將幼苗分別置于4 ℃光照培養(yǎng)箱3 h、6 h與9 h。處理后取幼苗第4片真葉在液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

分別在紫蘇不同發(fā)育時(shí)期從大田取回根、莖、葉、花、種子等試驗(yàn)材料，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TRNzol RNA提取試劑盒提取‘晉蘇1號(hào)’不同器官及不同逆境脅迫處理后葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋至100 ng·μL-1保存?zhèn)溆谩Ｋ迷噭┖匈徺I自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3PfPDAT1基因生物信息學(xué)分析

從高通量測序獲得的紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得PfPDAT1基因的cDNA序列，通過BLAST(http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源序列比對(duì)后，運(yùn)用在線分析軟件對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)紫蘇PfPDAT1蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用PSORT II(http://psort.hgc.jp/form2.html)和NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)PfPDAT1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測；通過SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)PfPDAT1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測；采用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在線軟件對(duì)PfPDAT1蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析與建模。運(yùn)用MEGA7多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇PfPDAT1蛋白與其它多種高等植物氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4PfPDAT1基因的表達(dá)特性分析

以18SrRNA作為內(nèi)參基因[10]，用于基因表達(dá)特性分析，應(yīng)用CFX96TMOptics Module(BIO-RAD)熒光定量分析儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)體系(10 μL)：cDNA模板1 μL、2×SYBR Premix EX TaqⅡ(Tli RnaseH Plus) 5 μL、10 μmol·L-1PfPDAT1-F 0.4 μL、10 μmol·L-1PfPDAT1-R 0.4 μL、50×ROX Reference 0.2 μL、dd H2O 3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30次循環(huán)；65 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PfPDAT1基因的序列特征

紫蘇PfPDAT1基因cDNA全長序列為2 097 bp，其中包括1 554 bp開放閱讀框，編碼517個(gè)氨基酸殘基(圖1)。推測的蛋白分子式為C2536H3893N685O757S26，相對(duì)分子量為56.9235 kDa，其理論等電點(diǎn)pI為5.45，不穩(wěn)定系數(shù)為33.52，理論半衰期為30 h，說明紫蘇PfPDAT1基因編碼的蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂溶系數(shù)為74.95，親水性系數(shù)為-0.276，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。PSORT II數(shù)據(jù)庫亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，紫蘇PfPDAT1被定位于細(xì)胞質(zhì)的可信度達(dá)69.6%，可判斷其為膜內(nèi)蛋白，且定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖1 PfPDAT1基因全長cDNA序列及翻譯氨基酸序列Fig.1 Full-length of cDNA and deduced amino acid sequences of PfPDAT1 gene注: 下劃線 ATG 為起始密碼子；TAA 為終止密碼子；方框?yàn)楸Ｊ氐?PfPDAT 1結(jié)構(gòu)域。Note: ATG (Start codon) and TAA (stop codon) are shown in underline; boxes delineate the conserved domain of PfPDAT1．

應(yīng)用SOPMA軟件預(yù)測的PfPDAT1二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示：PfPDAT1具有35.98 % α-螺旋，5.61 % β-轉(zhuǎn)角，16.05 %延伸鏈和42.36 %無規(guī)則卷曲。其三維結(jié)構(gòu)如圖2所示與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相似，紫蘇PfPDAT1蛋白主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲組成，而β-轉(zhuǎn)角與延伸鏈則分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。通過NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)該基因進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，PfPDAT1全長序列符合PLN02517 super family(phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase)超家族特征，PLN02517屬于磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶超家族，據(jù)此預(yù)測PfPDAT1具有?；D(zhuǎn)移功能。

圖2 紫蘇PfPDAT1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Tertiary structure of PfPDAT1 protein注：藍(lán)色螺旋表示C端；紅色螺旋表示N端。Note: Blue represents the C-terminal helix;red represents the N-terminal helix.

2.2 紫蘇PfPDAT1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫蘇PfPDAT1的氨基酸序列在系統(tǒng)進(jìn)化上與其他物種具有高度同源性，說明已經(jīng)從紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得PfPDAT1基因cDNA片段。使用MEGA7軟件，構(gòu)建紫蘇與其他幾種植物PDAT1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由如圖3可見：紫蘇PfPDAT1與芝麻的親緣關(guān)系最近，聚在同一個(gè)亞組中；與油橄欖、麻風(fēng)樹和毛果楊相距較近，與擬南芥相距較遠(yuǎn)。

圖3 紫蘇PfPDAT1與不同物種PDAT1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PfPDAT1 and other PDAT1 proteins from different species

2.3 PfPDAT1基因在不同組織中的表達(dá)特性

由圖4可知，PfPDAT1基因在紫蘇根、莖、葉、花及種子中均有表達(dá)，但不同組織中表達(dá)量存在差異，其中在根系中表達(dá)量最低，而在種子中表達(dá)量相對(duì)較高，約是根系的3.2倍。推測紫蘇PfPDAT1基因在不同組織器官中的功能不同。

圖4 ‘晉蘇1號(hào)’不同組織中PfPDAT1表達(dá)特性分析Fig.4 Relative expression level of PfPDAT1 gene in different organs of ‘Jinsu 1’ 注：a、b、c、d和e代表在0.05水平方差分析差異顯著性。Note:a、b、c、d and e indicate significant difference at 0.05 level．

2.4 PfPDAT1基因在不同逆境條件下的表達(dá)特性

干旱、高鹽、低溫作為主要的非生物脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育。為研究PfPDAT1對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)，經(jīng)PEG、NaCl和低溫處理紫蘇幼苗后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測紫蘇PfPDAT1的相對(duì)表達(dá)量。由圖5 A可知，在不同濃度PEG6000處理下PfPDAT1表達(dá)量都有所提高，總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在PEG6000濃度為20% 時(shí)表達(dá)量最高；在不同濃度NaCl條件下PfPDAT1表達(dá)量都明顯提高，且在100 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高(圖5B)；低溫脅迫處理下PfPDAT1基因表達(dá)量都增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在低溫處理6 h時(shí)表達(dá)量最高(圖5C)。這些結(jié)果充分表明，干旱、高鹽和低溫處理能夠顯著誘導(dǎo)紫蘇PfPDAT1基因的表達(dá)。

圖5 PfPDAT1基因在不同逆境條件下的表達(dá)特性分析Fig.5 Relative expression level of PfPDAT1 gene under different stresses注：A：PEG脅迫下PfPDAT1基因的相對(duì)表達(dá)量；B：鹽脅迫下PfPDAT1基因的相對(duì)表達(dá)量；C：4 ℃低溫脅迫下PfPDAT1基因的相對(duì)表達(dá)量。a、b、c和d代表在0.05水平方差分析差異顯著性。Note: A：Relative expression level of PfPDAT1 under drought stress；B：Relative expression level of PfPDAT1 under salt stress；C：Relative expression level of PfPDAT1 under chilling stress. a, b, c and d indicates significant difference at 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

甘油三酯(triaeylglyeerols，TAG)是動(dòng)、植物體內(nèi)最主要的油脂貯藏形式，植物種子中TAG的合成和積累是一個(gè)十分復(fù)雜的生理過程。研究表明DGAT和PDAT是影響種子中TAG合成兩條途徑最后一步?；磻?yīng)的關(guān)鍵酶，對(duì)于調(diào)控種子油脂合成發(fā)揮重要作用[11]。有研究證實(shí)，DGAT和PDAT對(duì)于TAG的合成作用可能相互交疊[9～12]。在TAG不依賴于酰基-CoA的合成途徑中，磷脂：二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(phospholipid diacylglycerol acyltransferase，PDAT)被認(rèn)為是TAG合成的限速酶[8]。為了更好地了解PDAT酶在紫蘇生長發(fā)育過程中的重要作用，本研究對(duì)紫蘇PfPDAT1基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，獲得PfPDAT1基因的cDNA序列，其全長為2 097 bp，共編碼517個(gè)氨基酸殘基；結(jié)構(gòu)域分析表明紫蘇PfPDAT1具有明顯的植物PDAT結(jié)構(gòu)特征，并具有PDAT酶活性；多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)紫蘇PfPDAT1蛋白與芝麻、油橄欖、麻風(fēng)樹、毛果楊等植物的同源序列具有高度一致性，同源性最高達(dá)到89%，說明PDAT1基因具有高度保守性。

DGAT或PDAT基因過表達(dá)對(duì)植物種子中油脂合成具有重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DGAT1基因發(fā)生突變后，擬南芥種子中經(jīng)過PDAT1途徑合成的TAG含量僅為野生型的70%，且該基因催化產(chǎn)生的TAG中不飽和脂肪酸含量較多[9]。Sandager[13]等人發(fā)現(xiàn)，酵母DGAT發(fā)生突變時(shí)，TAG含量相比野生型下降50%，而當(dāng)PDAT和DGAT均發(fā)生突變時(shí)，TAG僅為野生型的1%。另外，擬南芥PDAT或DGAT1過表達(dá)的種子中TAG含量相比野生型均無明顯變化[14]。本研究對(duì)‘晉蘇1號(hào)’不同組織中PfPDAT1基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，PfPDAT1在‘晉蘇1號(hào)’的根、莖、葉、花和種子中均有表達(dá)，但不同組織中其表達(dá)量存在差異，PfPDAT1在根系中表達(dá)量最低，而種子中表達(dá)量最高，表明該基因在紫蘇種子發(fā)育過程中起重要作用。

植物抗逆性與膜脂內(nèi)不飽和脂肪酸含量呈正相關(guān)[6,15]。在許多植物中,鹽和干旱脅迫導(dǎo)致多不飽和脂肪酸減少[16]。Fan等研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸通過PDAT、三酰甘油脂肪酶和油脂等發(fā)生氧化反應(yīng)生成甘油三酯(TAG)，從而維持植物體內(nèi)膜脂的動(dòng)態(tài)平衡[17]。Pan等對(duì)綠衣衣藻的研究表明PDAT具有?；D(zhuǎn)移酶和脂肪酶2種活性，脅迫條件下，通過PDAT基因的過表達(dá)作用，TAG含量明顯提高，從而緩解逆境脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害[18]。本研究分析了‘晉蘇1號(hào)’不同逆境脅迫下PfPDAT1基因的表達(dá)特性，結(jié)果表明，不同逆境脅迫處理下PfPDAT1基因的表達(dá)量都有所增加，且呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中在100 mmol·L-1NaCl、20% PEG6000和4 ℃處理6 h時(shí)PfPDAT1基因表達(dá)量最高。推測PfPDAT1基因參與紫蘇應(yīng)答非生物脅迫的過程，該研究結(jié)果為探究紫蘇PfPDAT1在抵御逆境脅迫中的作用提供理論支撐。