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        三個遠交系豚鼠微衛(wèi)星遺傳結(jié)構(gòu)分析

        2018-12-03 11:10:52劉迪文譚海明陳雁虹
        中國比較醫(yī)學雜志 2018年11期
        關(guān)鍵詞:微衛(wèi)星豚鼠等位基因

        劉迪文,譚海明,陳雁虹,衛(wèi) 振

        (浙江大學實驗動物中心,杭州 310058)

        豚鼠由于其特有的生物學性狀,成為藥理學、毒理學、免疫學、眼耳科疾病研究及疫苗研發(fā)等領(lǐng)域常用的實驗動物,目前我國用于實驗的豚鼠主要是英國種花色豚鼠及哈脫萊DHP遠交系白色豚鼠[1]。本課題組用上述兩種豚鼠為親本,培育出白色Zmu-1: DHP及黑色Zmu-2: DHP遠交系豚鼠[2 - 3],其特征是融合了英國種豚鼠遺傳雜合性和DHP豚鼠遺傳穩(wěn)定性的特點。由于育種過程中采取了近交及選擇措施,則同一位點的等位基因進行分離,重組到不同品系中,也可能某些性狀與毛色基因連鎖的緣故,因此,Zmu-1: DHP、Zmu-2: DHP品系及英國種三種不同毛色的豚鼠,遺傳及承載了不同的遺傳特性[4-6],成為研究某些正常生物學或疾病發(fā)生機理較理想的動物模型資源。

        遠交系動物遺傳質(zhì)量常需要借助于遺傳標記,通過計算群體遺傳結(jié)構(gòu)的數(shù)量遺傳指標來評估。微衛(wèi)星是一種穩(wěn)定可靠的第二代DNA分子遺傳標記,其序列長度的變化引起群體或個體遺傳標記出現(xiàn)差異,表現(xiàn)為同一微衛(wèi)星位點上,遠交系動物基因呈現(xiàn)遺傳多態(tài)性,而近交系動物則呈現(xiàn)一致性。優(yōu)良品質(zhì)的遠交系動物應具備基因多態(tài)性及遺傳穩(wěn)定性,利用多個微衛(wèi)星標記可以評價動物遺傳質(zhì)量,另外,篩選出與性狀連鎖的微衛(wèi)星位點能夠通過遺傳定位分析,輔助定位目的性狀基因。相對大小鼠,將微衛(wèi)星技術(shù)用于豚鼠遺傳結(jié)構(gòu)分析的文章較少,目前僅見朱亮[7]、李芳芳[8]、劉迪文[9]及Burgos-Paz[10]等人報道。本文擬用45對多態(tài)性引物,分析本中心三個遠交系豚鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)的多態(tài)性,并從中篩選出與豚鼠特征性狀連鎖的微衛(wèi)星位點,為評估豚鼠遺傳質(zhì)量,豚鼠品質(zhì)資源維持及應用選擇提供相關(guān)的遺傳背景依據(jù),同時為豚鼠優(yōu)勢性狀基因定位及其機理研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物

        英國種花色豚鼠,于70年代引自浙江農(nóng)村,引進后長期封閉遠交繁殖;Zmu-1: DHP白色豚鼠,2000年由英國種與HDP遠交系白色豚鼠(1987年引自中檢所)通過雜交-近交-遠交方式育成的遠交系;Zmu-2: DHP黑色豚鼠,Zmu-1: DHP豚鼠培育同時分離出的另一遠交系。三個種群豚鼠年齡約為30日齡,體重約350 g,均為普通級,性別不論,使用數(shù)量分別為15只、20只及15只[SCXK (浙) 2012 - 0052]。豚鼠采用屏障設(shè)施開放飼養(yǎng)[SYXK (浙) 2012 - 0178],0.9 m × 0.6 m × 0.25 m塑料籠盒加鋪滅菌木片及稻草作為墊料,飼喂顆粒飼料及自來水,并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

        1.2 主要試劑與儀器

        DNA提取試劑盒(Takara)、PCR試劑盒(Promega)、聚丙烯酰胺(Sigma)、硝酸銀(國產(chǎn));冷凍離心機(Eppondorf)、Nanodrop-one(Thermo)、PCR儀(ABI)、電泳儀(Bio-Rad)、凝膠成像儀(Bio-Rad),等等。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 DNA模板提取

        取三個種群豚鼠,每只心臟取血1 mL,肝素抗凝。用試劑盒提取豚鼠DNA,定量,ddH2O濃度調(diào)整至30 ng/μL。

        1.3.2 模板PCR擴增

        選取文獻[11]介紹的其中45對引物,由Invitrogen公司合成。PCR配方成分:10× PCR Buffer(Mg2+)2 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1 μL,rTaq(5 U/μL,Takara)0.2 μL,Primer F(10 mmol/L)0.5 μL,Primer R(10 mmol/L)0.5 μL,Template DNA(約50 ng)1 μL,ddH2O補足至20 μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min;然后進入45個循環(huán),每循環(huán)包括95℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸30 s,各引物退火溫度見文獻[11];最后72℃延伸5 min,4℃維持擴增產(chǎn)物。

        1.3.3 PCR產(chǎn)物電泳及條帶分析

        將PCR產(chǎn)物用12%聚丙乙酰胺凝膠電泳,電泳條件:電壓120 V,電泳時間2 ~ 3 h,0.1% AgNO3溶液染色,對電泳凝膠照像。按照小鼠電泳條帶標記法,標記豚鼠微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物電泳條帶,從快到慢條帶分別標記為a、b、c、d等。

        1.4 統(tǒng)計學方法

        根據(jù)每對引物對三個豚鼠種群擴增產(chǎn)物電泳條帶的不同位置確定基因型,利用POPGENE 3.2軟件統(tǒng)計三個群體在45個微衛(wèi)星位點上的平均等位基因數(shù)(Number of alleles)、平均有效等位基因數(shù)(Number of effective alleles)、平均觀測雜合度(Observed heterozygosity)、平均期望雜合度(Expected heterozygosity)、平均多態(tài)信息含量(Polymorphism information content)和平均Hardy-Weinberg平衡指數(shù)(Hardy-Weinberg Equilibrium index)。同時,采用Nei方法計算群體間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)Fst。使用MEGA 3.0軟件,采取UPGMA方法根據(jù)三個群體的遺傳距離進行聚類。

        2 結(jié)果

        2.1 微衛(wèi)星位點PCR產(chǎn)物電泳條帶

        45對引物中兩對引物擴增的PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖1??梢娙齻€豚鼠種群的微衛(wèi)星位點DNA條帶清晰、分辨率較高,在種群及個體間呈現(xiàn)遺傳多態(tài)性,說明這些位點可作為豚鼠遺傳結(jié)構(gòu)分析及遺傳質(zhì)量檢測的標記。

        注:A:L74引物;B:D86引物。M:250 bp分子標記;泳道1 ~ 20:Zmu-1: DHP遠交系;泳道21 ~ 35:英國種;36 ~ 50:Zmu-2: DHP遠交系。圖1 三個品系豚鼠微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Note. A: L74 Primer. B: D86 Primer. M: 250 bp Marker; Lane 1-20: Zmu-1: DHP outbred strain; Lane 21-35; England species; Lane 36-50: Zmu-2: DHP outbred strain.Figure 1 Electrophoretogram of PCR analysis of microsatellites in the three guinea pig groups

        2.2 豚鼠微衛(wèi)星位點基因型頻率及數(shù)量統(tǒng)計

        根據(jù)引物擴增產(chǎn)物作為電泳標記,統(tǒng)計豚鼠等位基因型頻率、等位基因數(shù)及有效等位基因數(shù),見表1。從表中可見,三個豚鼠種群的大部分微衛(wèi)星位點呈多態(tài)性變化,所有位點電泳條帶在2~7條之間,其中1個位點有7個等位基因,1個位點有4個等位基因,6個位點有3個等位基因,37個位點有2個等位基因。45個微衛(wèi)星位點共有等位基因103個,平均等位基因數(shù)Na為2.29,平均有效等位基因數(shù)Ne為1.74。

        2.3 三個豚鼠種群遺傳多樣性分析

        計算得到的觀測雜合度、期望雜合度及PIC見表2。從中可見,三個種群的總平均期望雜合度He為0.394,總平均觀測雜合度Ho為0.212。另外,三個豚鼠種群之間的期望雜合度及觀測雜合度差異無顯著性(P> 0.05)。所有位點的多態(tài)信息含量PIC的可信度范圍為0.0739 ~ 0.6443,平均為0.319,其中可信度> 0.5的高度多態(tài)性位點有2個,占4.44%,0.5 ~ 0.25的中度多態(tài)性位點有31個,占68.89%,< 0.25的低度多態(tài)性位點有12個,占26.67%。

        2.4 豚鼠種群的哈代-溫伯格遺傳平衡分析、豚鼠群體間遺傳分化

        Hardy-Weinberg(HW)平衡卡方顯著性分析、群體間遺傳分化分析結(jié)果見表3。從表中可見,三個豚鼠種群總的HW平衡P值為0.1734,三個種群各自的平均P值均> 0.05,群體偏離遺傳平衡程度不顯著。但對每個位點的基因平衡狀態(tài)進行分析,三個種群共至少有20個位點極顯著偏離HW平衡,其中種群1有16個,種群2有13個,種群3有14個。平均偏離指數(shù)D為-0.407,表明群體存在HW遺傳平衡偏離,同時又存在雜合子缺失現(xiàn)象。

        三個種群的平均分化指數(shù)Fst為0.136,提示由遺傳分化引起種群差異的因素是13.6%,86.4%的差異是種群內(nèi)遺傳不同引起,種群間屬于中度分化;種群近交程度Fis為0.318,且大多數(shù)位點呈正值,說明這些種群內(nèi)部的近交現(xiàn)象較嚴重;基因流Nm平均為5.835,表明育種過程中種群間存在基因交流,也說明基因交流是形成不同種群的主要原因,而遺傳分化引起的因素較小。

        表1 三個豚鼠種群微衛(wèi)星位點的基因型頻率、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)Table 1 Genotypic frequencies, number of alleles, and number of effective alleles of the microsatellite loci of the three guinea pig groups

        注:*表示種群間有差異的微衛(wèi)星位點;**表示有特殊等位基因的位點。

        Note.*Differential locus between guinea pig groups;**Specific locus.

        表2 三個品系豚鼠的觀測雜合度、期望雜合度及PIC

        注:種群1:Zmu-1: DHP豚鼠;種群2:英國種豚鼠;種群3:Zmu-2: DHP豚鼠。*高度多態(tài)性位點;**低度多態(tài)性位點;不標注:中度多態(tài)性位點。

        Note. Group 1: Zmu-1: DHP; Group 2: England species; Group 3: Zmu-2: DHP.*High polymorphic locus;**Low polymorphic locus; No mark indicates a moderate polymorphic locus.

        表3 豚鼠群體哈代-溫伯格遺傳平衡、Fis、Fst、基因流

        注:星號以下為遺傳距離,星號以上為遺傳相似性系數(shù)。

        Note. Under the asterisk: genetic distance; Above the asterisk: genetic similarity coefficient.

        圖2 基于遺傳距離的三個種群的UPGMA聚類圖Figure 2 UPGMA cluster graph of genetic distance

        2.5 遺傳相似度及遺傳距離

        三個種群間的Nei遺傳距離及遺傳相似度見表4,圖2是三個種群的聚類圖。從表圖可見Zmu-1: DHP的遺傳結(jié)構(gòu)與英國種較近,與Zmu-2: DHP較遠,英國種與Zmu-2: DHP兩者最近。

        3 討論

        實驗動物的遺傳類型決定了動物的用途及實驗效果。從遺傳學角度來說,近交系動物基因位點上所具有的基因單一,質(zhì)量檢測評定比較簡單,而遠交系動物遺傳呈多樣性,不同個體的同一位點上存在多種基因,使得其遺傳質(zhì)量評定變得比較復雜。遠交系動物的遺傳質(zhì)量一般通過位點各等位基因的發(fā)生頻率來評價,質(zhì)量較好的遠交系動物其基因位點雜合性較高,但群體同一位點多次測定的基因頻率基本能夠保持穩(wěn)定。微衛(wèi)星DNA通常是插入性狀基因,與性狀基因連鎖的基因片段,可作為性狀基因的遺傳標記,通過檢測微衛(wèi)星的遺傳信息,一般就能獲知某些性狀基因的遺傳信息,或闡明個體及群體的遺傳構(gòu)成。本文探討了我校三個遠交系豚鼠種群的數(shù)量遺傳特性,從表1、2可見,各微衛(wèi)星位點平均基因數(shù)、總雜合度及多態(tài)信息量等指標判斷,這些種群的遺傳多態(tài)性較低,處于中等偏下水平。查其原因可能與種群數(shù)量較小、初期曾采用近親繁殖及選種呈局限性等因素有關(guān)。朱亮等曾報道,他們的豚鼠群體處于中度遺傳多態(tài)性水平。事實上,實驗動物遠交系動物不同于其他動物,群體較小,長期封閉繁殖,容易形成近親繁殖。但本結(jié)果中多數(shù)微衛(wèi)星位點的PIC較高,這些位點可用于遠交系豚鼠遺傳檢測。

        通過比較遠交系動物種群間遺傳結(jié)構(gòu),及鑒定其多態(tài)性變化是由群體內(nèi)個體變異,還是群體間遺傳分化引起的差異,對判斷種群是同種還是異種很有必要。我校三個豚鼠種群中,Zmu-1: DHP(白色)及Zmu-2: DHP(黑色)種群都源自英國種豚鼠(花色),從表3中Fst、Fis、基因流值及表4遺傳距離可見,三個種群的遺傳相似度較高,并且純合子個體較多,缺少雜合子個體,雖然種群間遺傳處于中等分化水平,但通過基因交流阻止了遺傳分化的影響,說明三個群體豚鼠屬于一個種屬下的不同亞群。相對來講,英國種與Zmu-2: DHP遺傳距離最近,與Zmu-1: DHP較近,而Zmu-1: DHP及Zmu-2: DHP相對較遠。這種情況似乎與毛色相似度有關(guān),說明花色和黑色都是有色豚鼠,遺傳結(jié)構(gòu)較近;白色與有色豚鼠屬于完全不同的毛色,其群體間遺傳結(jié)構(gòu)則較遠。從表3三個種群的具體位點看,少數(shù)位點極顯著偏離遺傳平衡,多數(shù)位點遺傳偏離平衡不顯著,但結(jié)合偏離指數(shù)看,整個種群仍處于不平衡水平。Kl?ting等[12]曾指出,實驗動物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離是常見的問題。因此,為了提高本遠交系豚鼠種群的遺傳質(zhì)量,今后必須擴大每個種群的個體數(shù)量,原先每個種群為30盒,現(xiàn)起碼要擴充至50盒以上;要盡量遍布所有籠盒內(nèi)選擇豚鼠種子,每個籠盒只選擇單一性別的個體留種,避免同胞兄妹繁殖;如有必要可引入其他遠交系豚鼠,與現(xiàn)有豚鼠雜交后再采取遠交封閉4代以上育種,以滲入其他基因,豐富種群的遺傳多樣性。

        除了評價群體遺傳結(jié)構(gòu)外,某些微衛(wèi)星位點還可作為性狀基因的風向標,用于性狀基因定位。課題組曾發(fā)現(xiàn)不同種群豚鼠在多個性狀方面呈顯著差異性[4, 6],例如白色豚鼠多為近視及對某些病毒敏感,而有色尤其是黑色豚鼠多為遠視,并對某些病毒呈現(xiàn)抗性,說明這些性狀差異與豚鼠品系遺傳間存在相關(guān)性。微衛(wèi)星是性狀基因內(nèi)含子中的重復序列,多態(tài)性微衛(wèi)星位點的不同等位基因,常與某些相對性狀或基因,如近視及遠視性狀及基因分別連鎖。如果已知該微衛(wèi)星的染色體位置,通過進一步種群間連鎖分析,就可以定位性狀基因,已有多篇文獻報道了微衛(wèi)星基因定位的研究結(jié)果[13-14]。因此,篩選到符合基因定位要求,即與相對性狀連鎖的多態(tài)性微衛(wèi)星標記是關(guān)鍵。本文根據(jù)表1的豚鼠微衛(wèi)星位點基因型頻率,篩選出12個呈種群差異的位點(帶*標記),可能作為基因定位的分子標記。另外,還篩選出7個白色豚鼠或有色豚鼠種群的特征性微衛(wèi)星標記(帶**標記),例如L26位點上兩個有色豚鼠攜帶c基因,而白色豚鼠則缺少c基因,有可能作為特征性狀基因的指示標記。

        總之,本文報道了我校三個遠交系豚鼠種群的遺傳多態(tài)性,評估了這些豚鼠種群的遺傳質(zhì)量,同時報道了與不同種群或毛色性狀相關(guān)的多態(tài)性微衛(wèi)星位點,為今后豚鼠育種及遺傳鑒定,優(yōu)勢性狀基因定位及其遺傳機理研究等提供基礎(chǔ)資料。

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