張修彥，高亞奇，陳偉盛，梁 寧，詹純列

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，廣州 510010)

肺癌是世界各國常見的惡性腫瘤之一，它嚴(yán)重威脅人類健康，近20年發(fā)病率逐年上升。估計(jì)到2030年，全球?qū)⒂?30萬人死于吸煙有關(guān)的疾病，其中肺癌占3.1%[1]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%以上。在非小細(xì)胞肺癌中，RAS是最常突變的基因，約25%的腫瘤可檢測到[2]。B6.129S4-Krastm4Tyj/J攜帶KRASG12D點(diǎn)突變和Loxp-Stop-Loxp序列，KRASG12D不表達(dá)，從鼻腔滴入Cre腺病毒，可以啟動KRASG12D的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肺癌且肺癌發(fā)生率很高[3,4]。本研究利用此方法誘發(fā)肺腺瘤，對其進(jìn)行血生化、血常規(guī)、尿液、病理檢測，得到一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，供有需要的人員參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級B6.129S4-Krastm4Tyj/J小鼠及SPF級野生型小鼠從南京模式動物中心冷凍復(fù)蘇獲得。體重18～22 g，1.5月齡，B6.129S4-Krastm4Tyj/J小鼠7只(雌3只，雄4只)，野生型3只(雌1只，雄2只)。實(shí)驗(yàn)分組為B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre處理組4只(2只雌，2只雄)，B6.129S4-Krastm4Tyj/J對照組3只(1只雌，2只雄)，野生型對照組3只(1雌，2只雄)。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK (蘇) 2015-0001。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境中，使用許可證號：SYXK (粵) 2014-0100，飼喂購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的無菌鼠料。飲用水為經(jīng)消毒過濾的自來水，飼料和水自由攝取。每周更換兩次墊料和籠具，進(jìn)出屏障環(huán)境的物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒，嚴(yán)格遵守屏障系統(tǒng)SOP。小鼠取材、建模在超凈工作臺中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物3R原則，給予實(shí)驗(yàn)動物關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合福利倫理要求，實(shí)驗(yàn)動物福利倫理批準(zhǔn)號：201801203。

1.2 主要試劑與儀器

Cre腺病毒(5 × 1010，100 μL購自百恩維生物技術(shù)有限公司)。One Step Mouse Genotyping Kit(廠商Vazyme)、URIT尿試紙條(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司生產(chǎn))、ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、CRE、T-BIL、D-BIL、CK、UA試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)、Trizol(TAKARA公司)，Bestar qPCR RT kit(DBI公司)、Bestar qPCR MasterMix(DBI公司)、DEPC(MACKLIN公司)、異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)MEM培養(yǎng)基(廣州威佳科技有限公司)、石蠟(廣東大川特種蠟有限公司)、環(huán)保透明劑(武漢宏茲生物技術(shù)有限公司)、曙紅(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、蘇木素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、環(huán)保封片膠(武漢宏茲生物技術(shù)有限公司)。

超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)、紫外分光光度計(jì)UV-1206(日本Shimadzu公司產(chǎn)品)、冷凍離心機(jī)SCR20B(日本Hitachi公司產(chǎn)品)、臺式低溫高速離心機(jī)Z323K(德國Hermle公司產(chǎn)品臺式)、高速離心機(jī)TGL-16G(上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品)、水平式電泳儀(北京東方儀器廠產(chǎn)品GDS7600)、空氣恒溫振蕩器(江蘇大倉醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品)、ABI Real time PCR儀(ABI公司)、Stratagene Real time PCR儀(Agilent公司)、PCR擴(kuò)增儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)、電子天平BS210S(日本Satorius公司產(chǎn)品)、尿液分析儀URIT-330(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司)、全自動血液細(xì)胞分析儀BC-5000(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、全自動生化分析儀日立7020(日本柱式會社日立高新技術(shù))、RWD510小動物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、全自動脫水機(jī)ASP300S型(Leica?)、生物組織包埋機(jī)EG1150型(Leica?)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)RM2235型(Leica?)、攤片機(jī)HI1210型(Leica?)、烘片機(jī)HI1220型(Leica?)、自動染色機(jī)AutoStainer-XL型(Leica?)、Olympus?生物顯微鏡BX43型、Olympus?顯微圖像軟件CellSens Dimension。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠基因型鑒定

取3～5 mm小鼠尾尖，根據(jù)需要裂解樣品數(shù)量配制適量1×裂解液(4 μL Proteinase K + 200 μL 1× mouse tissue lysis buffer),在滅菌1.5 mL EP管中，添加200 μL 1×裂解液至所需裂解組織中(確保組織全部浸末至裂解液中)，渦旋震蕩后在55℃水浴中孵育30 min，孵育完成后，將樣品置于沸水浴中加熱5 min滅活Proteinase K,將裂解產(chǎn)物渦旋震蕩充分混勻后，12 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一滅菌EP管中，取適量做PCR擴(kuò)增，剩余上清保存于-20℃。引物信息見表1，PCR反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

1.3.2 小鼠肺腺瘤動物模型的建立

用小動物氣體麻醉機(jī)對小鼠進(jìn)行麻醉，再以AdCre 100 μL(1 × 109)分別滴入B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre組及野生型對照組兩邊鼻孔。AdCre滴液構(gòu)成為2×109AdCre 50 μL加45 μL MEM培養(yǎng)基和6 μL 2.5 mol/L的氯化鈣[4]。每7 d重復(fù)一次，共四次。在第30天處死小鼠取肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色。

1.3.3 尿常規(guī)、血常規(guī)、血生化檢測

利用小鼠代謝籠采集12 h尿液用于尿常規(guī)檢測。EDTA采血管眼眶采血用于血常規(guī)檢測。干燥管眼眶采血用于血生化檢測。

1.3.4 肺腺瘤熒光定量PCR檢測Cre表達(dá)

以Cre序列為模版設(shè)計(jì)引物Cre F：5’-TTAA TCCATATTGGCAGAACG-3’,Cre R：5’-AGACGGAA ATCCATCGCTC-3’,內(nèi)參β-actin F：5’-CATTGCT GACAGGATGCAGA-3’，β-actin R：5’-CTGCTGGA AGGTGGACAGTGA-3’。提取B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre處理組、野生型對照組肺組織RNA，擬轉(zhuǎn)錄cDNA，熒光定量PCR檢測Cre表達(dá)情況。

1.3.5 肺腺瘤病理學(xué)檢查

肺組織標(biāo)本經(jīng)取材、固定、修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，石蠟切片、HE染色、封片。顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基因鑒定結(jié)果

基因鑒定結(jié)果表明2、13、14、16、18、19、20基因型為Kras+/-，為實(shí)驗(yàn)所需陽性鼠。21、22、23為野生型對照。見圖1。

2.2 肺腺瘤小鼠血生化、血常規(guī)、尿常規(guī)指標(biāo)

測定結(jié)果表明：肺腺瘤小鼠與對照組相比低密度脂蛋白膽固醇、平均血小板體積升高，且差異有顯著性(P<0.01)；直接膽紅素與對照組相比升高、高密度脂蛋白膽固醇與對照組相比降低，且差異有顯著性(P<0.05)。見表3～5。

表1 引物信息

表2 PCR反應(yīng)體系

2.3 熒光定量PCR結(jié)果

熒光定量PCR結(jié)果顯示，B6.129S4-Krastm4Tyj/JCre組及野生型對照組鼻腔滴入Cre腺病毒的小鼠，肺組織能夠表達(dá)Cre。見圖2。

肺部腺瘤：肺部見多處腫瘤、膨脹性生長、邊界清晰，瘤細(xì)胞呈立方上皮樣、排列呈不規(guī)則腺管狀，未見核分裂像。見圖3。

2.4 肺腺瘤造模結(jié)果

解剖取材發(fā)現(xiàn)4只陽性鼠均發(fā)現(xiàn)腫瘤,對照組未發(fā)現(xiàn)腫瘤，腫瘤數(shù)量見表6。

圖1 Kras基因鑒定Figure 1 Identification of the Kras gene

測定項(xiàng)目Item肺腺瘤Pulmonary adenoma對照組ControlP值P-value谷丙轉(zhuǎn)氨酶Alanine aminotransferase (ALT)26.75±2.5075.00±32.790.13谷草轉(zhuǎn)氨酶Aspartae aminotransferase (AST)147.25±32.90232.00±65.780.07堿性磷酸酶Alkaline phosphatase (ALP)24.25±16.8424.67±2.520.26總蛋白Total protein (TP)64.50±2.5562.05±1.570.29白蛋白Albumin (ALB)33.33±1.6233.87±0.550.57球蛋白Globulin (GLOB)31.18±1.5628.63±1.050.06白蛋白/球蛋白Albumin/Globulin (A/G)1.07±0.061.18±0.030.04葡萄糖Glucose (GLU)4.93±1.905.27±2.760.85總膽固醇Total cholesterol (TC)1.95±0.272.29±0.180.10甘油三酯Triglycerides (TG)1.00±0.220.95±0.110.76高密度脂蛋白膽固醇High density lipoprotein cholesterol (HDL-C)0.97±0.111.34±0.1880.02低密度脂蛋白膽固醇Low density lipoprotein cholesterol (LDL-C)0.11±0.010.05±0.010.00尿素氮Urea nitrogen (BUN)8.62±0.959.10±3.130.82肌酐Creatinine (CRE)11.70±2.6210.70±0.400.28總膽紅素Total bilirubin (T-BIL)1.38±0.400.73±0.100.05直接膽紅素Direct bilirubin (D-BIL)0.68±0.150.37±0.070.02直接膽紅素/總膽紅素Direct bilirubin/Total bilirubin (D/T)0.50±0.040.51±0.060.81間接膽紅素Indirect bilirubin (I-BIL)0.70±0.250.51±0.060.07肌酸激酶Creatine kinase (CK)1363.25±711.441610.67±499.420.62尿酸Uric acid (UA)31.25±1.2639.00±4.360.08

表4 肺腺瘤血常規(guī)指標(biāo)±s)

表5 肺腺癌小鼠尿常規(guī)指標(biāo)±s)

注：A：擴(kuò)增曲線；B：溶解曲線。圖2 Cre mRNA的熒光定量PCR鑒定Note. A: Amplification curve. B: Dissolution curve.Figure 2 Quantitative PCR analysis of Cre mRNA

小鼠序號Serial number of mice腫瘤數(shù)量(個(gè))Number of tumors腫瘤體積(mm3)Tumor volume137.40±2.52259.92±8.273515.07±6.124413.61±5.99平均值A(chǔ)verage value4.2510.81±6.38

圖3 肺腫瘤(HE染色，× 100、× 400)Figure 3 Histology of the mouse lungs. HE staining (× 100, × 400)

3 討論

利用B6.129S4-Krastm4Tyj/J小鼠鼻腔滴注Cre腺病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生肺腫瘤的方式非常方便也很高效，4只陽性鼠均產(chǎn)生多處肺腺瘤,平均個(gè)數(shù)4.25個(gè)，體積(10.81±6.38) mm3，B6.129S4-Krastm4Tyj/J對照組及野生型對照組均未發(fā)現(xiàn)腫瘤。如果延長實(shí)驗(yàn)周期,預(yù)計(jì)可獲得肺腺癌模型。低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇負(fù)責(zé)膽固醇運(yùn)輸，低密度脂蛋白膽固醇負(fù)責(zé)將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝外組織細(xì)胞，高密度脂蛋白膽固醇則相反[5]。已經(jīng)有研究報(bào)道在多個(gè)部位HDL-C與癌的反比例關(guān)系，其中包括肺部[6-8]。本研究中肺腺瘤小鼠的高密度脂蛋白膽固醇比對照組低，與之前研究結(jié)果一致。Catarina Rodrigues dos Santos等[9]統(tǒng)計(jì)了244個(gè)乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白膽固醇含量高的病人腫瘤更大、有更高的分化等級、更高的增生比率。本研究發(fā)現(xiàn)肺腺瘤小鼠低密度脂蛋白膽固醇比對照組高。膽紅素主要在肝臟代謝，包括肝細(xì)胞對血液內(nèi)膽紅素的攝取、運(yùn)載、未結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)化為結(jié)合膽紅素、結(jié)合膽紅素膽汁排泄等一系列相互影響的生理過程。有研究表明膽紅素在肺癌中表現(xiàn)出抗氧化和抗腫瘤的作用[10 - 11]。Song等[12]的研究表明低水平直接膽紅素與晚期非小細(xì)胞肺癌和預(yù)后差相關(guān),血清膽紅素是非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺腺瘤小鼠的直接膽紅素指標(biāo)高于對照組，這可能是由于肺腺瘤小鼠肝臟疾病引起，具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。