程 龍，董世芬，袁悅瑩，馬 丹，宋敬怡，孫建寧，張碩峰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 100029)

肥胖是一種多因素引起的慢性代謝疾病，是引發(fā)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥等相關(guān)疾病的主要因素，肥胖的發(fā)生與血瘀相關(guān)，活血化瘀方藥在治療肥胖過(guò)程中取得良好療效[1-3]。哺乳動(dòng)物的脂肪組織主要由儲(chǔ)脂為主的白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)與產(chǎn)熱為主的棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)組成。肥胖發(fā)生時(shí)，體內(nèi)白色脂肪組織與棕色脂肪組織比例失衡，白色脂肪組織過(guò)度堆積或分布異常。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肥胖是由于多種因素導(dǎo)致體內(nèi)膏脂堆積過(guò)多，進(jìn)而引發(fā)脾虛氣虧、瘀血、氣滯、痰濕等證候特征。研究表明，白色脂肪棕色化及活化棕色脂肪能增加機(jī)體產(chǎn)熱，調(diào)節(jié)能量代謝，是肥胖治療的有效環(huán)節(jié)之一[4-5]。

大黃來(lái)源于蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim. ex Balf)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根及根莖，性苦、寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃之功效[6]，具有降血脂、抗氧化、抗炎等作用[7 - 8]。大黃素(emodin)，學(xué)名1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)，是大黃的主要有效成分之一，為蒽醌類(lèi)衍生物，具有降血糖及降血脂[9]、抗衰老[10]、抗炎[11]等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型大鼠體重、血脂水平、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，減少白色脂肪中脂質(zhì)聚集和減小白色脂肪細(xì)胞直徑，改善能量代謝紊亂[12]。ApoE基因敲除小鼠因載脂蛋白E基因缺失，易出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常和白色脂肪堆積，是研究肥胖及相關(guān)代謝疾病的較佳模型[13-14]。因此，本研究以ApoE基因敲除小鼠為研究對(duì)象，觀察大黃素對(duì)ApoE基因敲除小鼠脂肪棕色化的影響，探討其治療肥胖等血瘀狀態(tài)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠24只，具有相同遺傳背景且同周齡的SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠8只，體重(20±2) g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供[SCXK (蘇) 2015-0001]，合格證號(hào)：201606277。所有小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK (京) 2016-0038]，室溫(25±2)℃、45%相對(duì)濕度，12 h/12 h光暗周期，飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食及飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，本研究由北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批準(zhǔn)，編號(hào)：BUCM-4-2016121001-4020。

1.2 主要試劑與儀器

大黃素(emodin)，購(gòu)于北京華威銳科化工有限公司，純度為98%，批號(hào)16HC0215-2；辛伐他汀，購(gòu)于杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)M029946；基礎(chǔ)飼料及高脂飼料，購(gòu)于北京科澳協(xié)力有限公司[SCXK (京) 2014-0010]；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)測(cè)試盒均由貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司提供，批號(hào)分別為AUZ4678、AUZ3692、AUZ4573、AUZ4289；UCP1抗體購(gòu)于Abcam公司，批號(hào)GR3188478-6；山羊抗兔二抗購(gòu)于無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司，批號(hào)K172414D。半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司)；全自動(dòng)真空脫水機(jī)(ASP3005，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司)；分體式包埋機(jī)(EG1150，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司)；多功能染色蓋片工作站(ST5020/CV5030，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司)；正置智能型顯微鏡(BX53，奧林巴斯(中國(guó))有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(CX4 Pro，美國(guó)貝克曼公司)；小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(Vevo TM 2100，加拿大Visual Sonics公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

ApoE-/-小鼠小鼠喂食高脂飼料(77.5%的基礎(chǔ)飼料，1.5%膽固醇，21%豬油)12周，之后隨機(jī)分為3組，即ApoE-/-模型組、辛伐他汀5.7 mg/kg組、大黃素80 mg/kg組，每組8只。C57BL/6J小鼠為正常對(duì)照組，全程喂食普通飼料。模型組和給藥組小鼠持續(xù)喂食高脂飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。小鼠至13周開(kāi)始給藥，模型組和正常對(duì)照組每日給予相同溶媒(飲用水)灌胃，辛伐他汀和大黃素分別按照5.7 mg/kg、80 mg/kg劑量[15]灌胃給藥，給藥體積為0.1 mL/10 g，連續(xù)干預(yù)18周，每周記錄各組小鼠體重。

1.3.2 心功能指標(biāo)檢測(cè)

將小鼠氣體麻醉、剃毛，用小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠心臟的射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)。

1.3.3 取材

干預(yù)18周后，禁食12 h，稱(chēng)取小鼠體重，取血約1.5 mL，3500 r/min，離心10 min，分離血清。取血后，解剖分離皮下腹股溝白色脂肪及肩胛區(qū)棕色脂肪，并稱(chēng)重，腹股溝白色脂肪組織放在10%中性福爾馬林固定液中固定。

1.3.4 脂肪重量/體重的測(cè)定

精確稱(chēng)重小鼠皮下腹股溝白色脂肪重量、肩胛部棕色脂肪重量，計(jì)算腹股溝白色脂肪重量(iWAT)/體重(WB)和肩胛區(qū)棕色脂肪重量(BAT)/體重(WB)的比值。

1.3.5 血脂的檢測(cè)

按照說(shuō)明，采用生化試劑盒測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的含量。

1.3.6 腹股溝白色脂肪HE染色

將固定在10%中性福爾馬林固定液中的腹股溝白色脂肪取出，常規(guī)石蠟包埋；切片；切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗；蘇木素液染色；水洗；鹽酸乙醇分色；自來(lái)水浸泡；伊紅染色；自來(lái)水沖洗；常規(guī)脫水；透明；封片；正置智能顯微鏡觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.7 腹股溝白色脂肪免疫組織化學(xué)染色

組織切片常規(guī)脫蠟、脫水；抗原修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；封閉；加UCP1一抗4℃過(guò)夜；過(guò)夜后，PBS清洗，滴加二抗；DAB顯色；終止顯色后蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)；常規(guī)脫水；透明；中性樹(shù)膠封片。棕黃色著色即為陽(yáng)性細(xì)胞抗原存在位置。

1.3.8 腹股溝白色脂肪組織UCP1蛋白表達(dá)的影響

使用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)，選取棕黃色處為陽(yáng)性著色，對(duì)陽(yáng)性表達(dá)處進(jìn)行AOD分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠體重的影響

如圖1所示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，與正常對(duì)照組比較，ApoE-/-小鼠體重顯著增加(P< 0.01)；與ApoE-/-模型組比較，自給藥第12周開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大黃素組、辛伐他汀組小鼠體重顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)。

注：與ApoE-/-模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖1 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠體重的影響Note. Compared with the ApoE-/- model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 1 Effect of emodin on body weight of the ApoE-/- mice

2.2 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠脂肪重量/體重比值的影響

如圖2A、2B所示，與正常對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織(iWAT)重量/體重(BW)的比值顯著降低(P< 0.01)，棕色脂肪組織(BAT)重量/體重(BW)的比值顯著降低(P< 0.01)；與ApoE-/-模型組相比，大黃素組、辛伐他汀組小鼠iWAT/BW顯著降低(P< 0.05)，BAT/BW的比值顯著增加(P< 0.05或P< 0.01)。

2.3 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平的影響

如圖3所示，與正常對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C含量顯著升高(P< 0.01)，HDL-C含量差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；與ApoE-/-模型組比較，大黃素組小鼠血清中TG、TC含量顯著降低(P< 0.05)；LDL-C含量具有降低趨勢(shì)，HDL-C含量增加，但差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)；辛伐他汀組小鼠血清中TG、TC、LDL-C含量顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)，HDL-C含量顯著增加(P< 0.05)。

2.4 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠心臟的射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率的影響

如圖4A、4B所示，與正常對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組小鼠心臟的EF、FS百分率顯著降低(P< 0.05)，提示心功能損傷；與ApoE-/-模型組比較，大黃素組、辛伐他汀組小鼠心臟的EF、FS百分率顯著增加(P< 0.01)。

2.5 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織形態(tài)的影響

如圖5所示，正常對(duì)照組小鼠腹股溝白色脂肪呈現(xiàn)出較大空泡狀，形狀近似圓形，組織比較致密(圖5A)；ApoE-/-模型組小鼠皮下腹股溝白色脂肪呈現(xiàn)出大空泡的脂肪室，且形狀不規(guī)則，細(xì)胞核、細(xì)胞器及胞漿被擠到一側(cè)呈薄環(huán)，白色脂肪特征明顯(圖5B)；與模型組相比，大黃素組(圖5C)、辛伐他汀組(圖5D)小鼠皮下腹股溝白色脂肪細(xì)胞出現(xiàn)多室，細(xì)胞變小、變圓，組織變的更加致密，具有棕色化趨勢(shì)。

2.6 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠iWAT部位UCP1蛋白表達(dá)的影響

觀察小鼠腹股溝白色脂肪組織免疫組織化學(xué)染色切片，棕黃色著色即為陽(yáng)性細(xì)胞抗原存在位置。與ApoE-/-模型組比較(圖6B)，大黃素組(圖6C)、辛伐他汀組(圖6D)iWAT中UCP-1陽(yáng)性表達(dá)顯著。利用Image-Pro Plus 6.0對(duì)其AOD進(jìn)行分析。圖7結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，ApoE-/-模型組小鼠皮下股溝脂肪組織AOD的值降低，但差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；與ApoE-/-模型組比較，大黃素組、辛伐他汀小鼠皮下腹股溝脂肪組織AOD的值顯著增加(P< 0.01)，進(jìn)一步提示其增加iWAT脂肪細(xì)胞棕色化特征。

注：與ApoE-/-模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖2 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠脂肪重量/體重比值的影響Note. Compared with the ApoE-/- model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 2 Effect of emodin on fat weight/body weight ratio in the ApoE-/- mice

注：與ApoE-/-模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖3 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平的影響Note. Compared with the ApoE-/- model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 3 Effects of emodin on the levels of serum TG, TC, LDL-C, and HDL-C in the ApoE-/- mice

注：與ApoE-/-模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠心臟EF、FS的影響Note. Compared with the ApoE-/- model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 4 Effect of emodin on changes of heart EF and FS in the ApoE-/- mice

注：A：正常對(duì)照組；B：ApoE-/-模型組；C：大黃素80 mg/kg組；D：辛伐他汀5.7 mg/kg組。圖5 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠腹股溝白色脂肪組織形態(tài)的影響(HE染色，× 400)Note. A: Control group; B: ApoE-/-model group; C: 80 mg/kg emodin group; D: 5.7 mg/kg simvastatin group. Figure 5 Effect of emodin on the histology of white adipose tissue in the inguinal region of ApoE-/- mice. HE staining

注：A：正常對(duì)照組；B：ApoE-/-模型組；C：大黃素80 mg/kg組；D：辛伐他汀5.7 mg/kg組。圖6 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織UCP1免疫組織化學(xué)染色的影響(× 400)Note. A: Control group; B: ApoE-/-model group; C: 80 mg/kg emodin group; D: 5.7 mg/kg simvastatin group. Figure 6 Effect of emodin on immunohistochemical staining of UCP-1 in white adipose tissue of the ApoE-/- mice

注：與ApoE-/-模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖7 大黃素對(duì)ApoE-/-小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織UCP1蛋白表達(dá)AOD的影響Note. Compared with the ApoE-/- model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 7 Effect of emodin on the protein expression of UCP1 in the inguinal white adipose tissue of ApoE-/- mice

3 討論

哺乳動(dòng)物的脂肪組織主要由白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)與棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)組成。WAT不僅是能量?jī)?chǔ)存的器官，同時(shí)也是重要的內(nèi)分泌器官，可通過(guò)內(nèi)分泌及旁分泌眾多細(xì)胞因子或脂肪因子影響機(jī)體的糖脂代謝平衡、血壓水平、炎癥反應(yīng)等，與血瘀證包括高血糖、高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。BAT的細(xì)胞主要由多泡脂肪構(gòu)成，其細(xì)胞內(nèi)含有大量線粒體，主要功能是消耗脂肪并發(fā)揮非顫抖產(chǎn)熱作用[16]。BAT的線粒體中含有特異性載體蛋白即UCP1。UCP1可以將H+從線粒體內(nèi)膜滲漏到線粒體基質(zhì)中，減少ADP磷酸化形成ATP，將能量以熱能的形式散失[17]。研究證實(shí)，當(dāng)機(jī)體交感神經(jīng)興奮時(shí)(如冷刺激[18]、β-腎上腺素受體激動(dòng)[19])，皮下白色脂肪組織中UCP1表達(dá)顯著增加，出現(xiàn)BAT的典型特征，如許多散在的小脂滴、線粒體數(shù)目增多、棕色脂肪的標(biāo)志基因[如誘導(dǎo)細(xì)胞死亡DNA片斷化因子α樣效應(yīng)因子(cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha like effector，CIDE)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(positive regulatory domain-containing 16，PRDM16)等]表達(dá)增多等，與血糖、血脂調(diào)控和體重減輕有關(guān)。

大黃素能降低高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的體重及血脂，減少白色脂肪組織的堆積，增強(qiáng)胰島素敏感性，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和改善相關(guān)代謝疾病的紊亂[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素能顯著降低高脂飲食ApoE基因敲除小鼠體重(P< 0.05)、白色脂肪重量/體重比值(P< 0.05)以及血清中TG和TC含量(P< 0.05)，同時(shí)其能顯著增加棕色脂肪重量/體重比值(P< 0.05)及左心室的射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率(P< 0.01)，具有減少白色脂肪堆積、改善脂質(zhì)代謝和心功能的作用此外，在脂肪棕色化過(guò)程中，小鼠腹股溝白色脂肪比附睪脂肪更加容易轉(zhuǎn)化[23]。通過(guò)對(duì)各組小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織HE染色發(fā)現(xiàn)，與ApoE-/-模型組比較，大黃素組小鼠腹股溝白色脂肪出現(xiàn)典型的棕色脂肪細(xì)胞表型(如細(xì)胞出現(xiàn)多室，細(xì)胞變小、變圓等)。已有報(bào)道證實(shí)大黃素可通過(guò)增強(qiáng)腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶的磷酸化及其主要下游靶向乙酰輔酶A羧化酶，上調(diào)肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1的基因表達(dá)，下調(diào)甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1，進(jìn)而減少白色脂肪組織中的脂質(zhì)積累[12]。本研究結(jié)果顯示，大黃素可顯著增加ApoE-/-小鼠腹股溝白色脂肪組織UCP1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步明確其促進(jìn)白色脂肪棕色化的作用。

綜上所述，大黃素可通過(guò)降低ApoE基因敲除小鼠體重、血清中甘油三酯、總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇含量和白色脂肪重量/體重比值，減少白色脂肪堆積，同時(shí)增加棕色脂肪重量/體重比值、左心室的射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率和皮下腹股溝白色脂肪組織UCP1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)ApoE基因敲除小鼠皮下腹股溝白色脂肪棕色化，從而有效抑制肥胖，可能與其逐瘀作用有關(guān)。