李艷艷，馮里茹，張紅敏，譚洪興，朱李佳，王 俊

(深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病，長期的代謝紊亂可引起全身多器官病變。肝是糖脂代謝的主要場所，也是胰島素作用的重要靶器官，肝損傷在DM發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[1]。

糖尿病肝損傷機(jī)制復(fù)雜，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肝損傷的關(guān)鍵機(jī)制并貫穿始終[2]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)中心，參與多種生理活動，然而，線粒體也是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要部位[3]。糖尿病狀態(tài)下，高糖高脂加重了線粒體負(fù)荷，在呼吸鏈電子傳遞中產(chǎn)生的過量ROS將自身作為首要靶標(biāo)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，進(jìn)一步加劇ROS的積聚導(dǎo)致肝嚴(yán)重?fù)p傷，從而加重糖脂代謝的紊亂，形成惡性循環(huán)[4 - 5]。因此，減輕線粒體損傷、修復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能對于防治糖尿病肝損傷具有重要意義。

線粒體生物合成(mitochondrial biogenesis)是核基因及線粒體基因協(xié)同調(diào)控下的重要生理活動，在線粒體結(jié)構(gòu)修復(fù)及功能維持過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。在糖尿病肝線粒體損傷情況下，增加線粒體生物合成對于恢復(fù)肝細(xì)胞正常糖脂代謝尤為重要。維生素D(vitamin D，VD)是一種脂溶性維生素，經(jīng)肝、腎轉(zhuǎn)化成活性形式1,25(OH)2VD3后與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，在糖脂代謝過程中亦發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[7]。然而，維生素D能否通過線粒體生物合成改善糖尿病肝損傷及相關(guān)機(jī)制目前鮮有研究。因此，本研究以維生素D缺乏狀態(tài)下的Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠為對象，探討1,25(OH)2VD3對糖尿病肝線粒體損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性自發(fā)性肥胖型2型糖尿病大鼠(ZDF大鼠)20只，體重(127.1±13.7) g，5～6周齡；SPF級雄性Zucker瘦型(Zucker lean，ZL)大鼠10只，體重(114.3±7.2) g，5～6周齡，購于維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0011]，動物飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK (鄂) 2016-0057]。本研究通過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(IACUC Number：432)。

1.2 主要試劑與儀器

1,25(OH)2VD3(Cayman)；2.5%戊二醛固定液(谷歌生物)；血清ALT、AST檢測試劑盒(南京建成)；MDA、GSH測定試劑盒(南京建成)；DHE熒光探針(南京碧云天)；線粒體提取試劑盒(碧云天)；四甲基羅丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)(Sigma-Aldrich)；RIPA裂解液(碧云天)；總蛋白提取試劑盒(南京碧云天)；蛋白定量試劑盒(Bio-Rad)；SIRT1抗體、PGC-1α抗體、TFAM抗體、NRF1抗體(Abcam)；HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記抗兔IgG抗體(CST)；ECL化學(xué)發(fā)光劑(Millipore)。倒置顯微鏡(奧林巴斯)；透射電子顯微鏡(Hitachi)；化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad)；熒光分光光度計(jì)(Thermo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組

所有大鼠在喂養(yǎng)過程中均按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，瘦型鼠為對照組(ZL)，胖型鼠按照體重隨機(jī)分為2組：模型組(ZDF)和維生素D干預(yù)組(ZDF + VD)，胖型鼠體重為105～152 g，分為105～110 g、111～120 g、121～130 g、130～140 g、141～152 g五個(gè)等級，然后將每個(gè)等級的大鼠隨機(jī)分為2組。喂養(yǎng)Zucker大鼠專用飼料Purina #5008(北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)，在原飼料配方基礎(chǔ)上去除添加的維生素D；1,25(OH)2VD3溶于玉米油中根據(jù)體重每兩天灌胃1次，劑量為每千克體重5 μg(劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)；ZL組與ZDF組大鼠灌胃等體積的玉米油。各組大鼠喂養(yǎng)至12周齡，喂養(yǎng)結(jié)束后，眼眶取血，迅速剝離肝，進(jìn)行電鏡及病理觀察的固定，其他肝組織分裝于-80℃保存。

1.3.2 肝損傷指標(biāo)檢測

按照血清ALT、AST檢測試劑盒操作步驟檢測各組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平；HE染色觀察肝病理改變；硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定心臟丙二醛(MDA)水平，二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)比色法測定心臟谷胱甘肽(GSH)水平；肝ROS檢測：肝組織冰凍切片孵育DHE熒光探針，熒光顯微鏡觀察紅色熒光強(qiáng)度并拍照。

1.3.3 肝超微結(jié)構(gòu)觀察

動物處死1 min內(nèi)迅速切取截面積為1 mm2的5 mm肝組織長條，用2.5%的戊二醛緩沖液固定，經(jīng)過處理后的切片用透射電子顯微鏡觀察肝超微結(jié)構(gòu)，尤其是線粒體的損傷。

1.3.4 線粒體膜電位測定

取100 mg新鮮肝組織用線粒體提取試劑盒提取線粒體，使用100 nmol/L TMRM熒光染料孵育(37℃，30 min)后，用熒光分光光度計(jì)讀取熒光強(qiáng)度。

1.3.5 線粒體生成相關(guān)蛋白的檢測

Western blot檢測肝線粒體生成相關(guān)蛋白NRF1、TFAM表達(dá)量及上游調(diào)節(jié)蛋白SIRT1、PGC-1α的表達(dá)。稱取100 mg左右肝組織，加入10倍體積的RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。利用SDS-PAGE電泳分離蛋白后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。根據(jù)抗體說明書進(jìn)行一抗和經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗孵育。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和灰度統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 1,25(OH)2VD3改善ZDF大鼠肝損傷

血清ALT、AST是反映肝損傷的敏感指標(biāo)。如圖1A所示：與ZL組相比，ZDF組大鼠肝細(xì)胞ALT、AST釋放水平顯著升高，血清ALT、AST水平約分別增加了8.3倍和6.8倍。1,25(OH)2VD3干預(yù)后明顯減輕了ZDF大鼠肝細(xì)胞ALT、AST的釋放。

喂養(yǎng)結(jié)束后，較ZL組相比，ZDF組大鼠肝出現(xiàn)明顯的病理改變，肝體積明顯增大，顏色變淺偏黃，HE染色結(jié)果顯示，ZL組大鼠肝小葉清晰，肝細(xì)胞索以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，沒有出現(xiàn)脂滴以及脂肪變性，細(xì)胞核為圓形，位于細(xì)胞中央；而ZDF組大鼠肝出現(xiàn)明顯的脂肪病變，彌漫性小泡脂滴幾乎占滿整個(gè)肝細(xì)胞；1,25(OH)2VD3干預(yù)有效緩解了ZDF大鼠肝病變。如圖1B所示。

注：A：大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平。與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。B：大鼠肝組織HE染色(× 200)。圖1 1,25(OH)2VD3對大鼠血清ALT、AST及肝病理損傷的影響Note. A: Serum transaminases of Zucker rats. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05. B: Liver histology.HE staining (× 200).Figure 1 Effect of 1,25(OH)2VD3 on serum transaminases and liver histology in the Zucker rats

2.2 1,25(OH)2VD3改善ZDF大鼠肝氧化損傷

圖2A展現(xiàn)的是肝ROS水平，較ZL組，ZDF組大鼠肝組織孵育DHE探針后紅色熒光顯著增強(qiáng)，ROS的產(chǎn)生明顯升高。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物——丙二醛(MDA)的水平能夠反映脂質(zhì)氧化損傷程度，谷胱甘肽(GSH)則反映機(jī)體抗氧化水平，如圖2B所示，與ZL組相比，ZDF組大鼠肝MDA水平顯著上升而GSH水平明顯降低，1,25(OH)2VD3干預(yù)后，MDA水平降低了約25%，GSH水平升高了約41%，顯著緩解了ZDF大鼠肝氧化損傷。

注：A：大鼠肝組織ROS水平(× 200)。B：大鼠肝谷胱甘肽及丙二醛水平。與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。圖2 1,25(OH)2VD3對大鼠肝氧化損傷的影響A: Liver ROS detected under a fluorescence microscope (× 200). B: Liver GSH and MDA detected by spectrophotometry. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05.Figure 2 Effect of 1,25(OH)2VD3 on oxidative damage in the ZDF rat liver

2.3 1,25(OH)2VD3對ZDF大鼠肝線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響

圖3A電鏡結(jié)果顯示：ZL組大鼠肝線粒體呈橢圓形、短棒狀或者圓形，大小均一；ZDF組大鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的脂滴，線粒體腫脹、形態(tài)異常并伴有空泡化；1,25(OH)2VD3干預(yù)后線粒體形態(tài)基本恢復(fù)正常。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)是反映線粒體膜損傷及功能的重要指標(biāo)，與ZL組相比，ZDF組大鼠肝MMP下降了約43%，1,25(OH)2VD3逆轉(zhuǎn)了線粒體膜通透性的改變，減輕了線粒體損傷(圖3B)。

2.4 1,25(OH)2VD3改善ZDF大鼠肝線粒體生物合成

線粒體生物合成對于機(jī)體維持和修復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。介導(dǎo)線粒體生物合成最重要的是PGC-1α及其下游轉(zhuǎn)錄因子NRF1和TFAM。如圖4所示，ZDF組大鼠肝組織中PGC-1α、NRF1及TFAM的表達(dá)比ZL組約分別降低了58%、38%及62%，此外，PGC-1α上游調(diào)節(jié)蛋白SIRT1的表達(dá)也顯著降低；1,25(OH)2VD3能夠上調(diào)線粒體生成相關(guān)調(diào)控蛋白SIRT1、PGC-1α及其下游NRF1和TFAM的表達(dá)，緩解ZDF大鼠肝線粒體穩(wěn)態(tài)失衡。

注：A：大鼠肝超微結(jié)構(gòu)(× 3500)，紅色箭頭指示線粒體。B：大鼠肝線粒體膜電位水平。與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。圖3 1,25(OH)2VD3對ZDF大鼠肝線粒體損傷的保護(hù)作用Note. A: Liver ultrastructure of Zucker rats observed by transmission electron microscopy (× 3500). Red arrows indicate mitochondria.B: Liver mitochondrial membrane potential. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05.Figure 3 Protective effect of 1,25(OH)2VD3 on hepatic mitochondrial injury in the ZDF rats

注：與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。圖4 1,25(OH)2VD3對ZDF大鼠肝線粒體合成的影響Note. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05.Figure 4 Protective effect of 1,25(OH)2VD3 on hepatic mitochondrial biogenesis in the ZDF rats

3 討論

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，可導(dǎo)致全身多個(gè)器官損害，肝損傷就是其中主要的損傷之一。研究發(fā)現(xiàn)，約50%的糖尿病患者合并肝病變，肝損傷在糖尿病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[8]。ZDF大鼠是從出現(xiàn)糖尿病表型的Zucker大鼠中篩選并近親雜交培育出的一種自發(fā)性糖尿病模型鼠[9]，ZDF大鼠經(jīng)高血脂高血糖、糖耐量異常、胰島素抵抗等程序化發(fā)展為2型糖尿病，被認(rèn)為是2型糖尿病及并發(fā)癥研究的理想動物模型[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠血清ALT、AST水平異常升高，肝出現(xiàn)損傷，組織病理切片顯示，ZDF大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性。

糖尿病肝損傷機(jī)制復(fù)雜，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激備受關(guān)注。在高糖高脂狀態(tài)下，過量的ROS會攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，引起肝的病變[12]。研究認(rèn)為，線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要場所，病理狀態(tài)下，呼吸鏈電子傳遞過程中大量產(chǎn)生的ROS將線粒體自身作為首要靶標(biāo)，造成線粒體結(jié)構(gòu)與功能的異常，加速ROS的生成，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重的氧化損傷[13]。本研究電鏡結(jié)果顯示，ZDF大鼠線粒體出現(xiàn)腫脹、變性、空泡化，線粒體膜電位也隨之降低。與此同時(shí)，ZDF大鼠肝ROS產(chǎn)生顯著增多、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高，最嚴(yán)重的是肝的抗氧化能力卻逐漸下降，表現(xiàn)為GSH耗竭，這些結(jié)果提示ZDF大鼠肝出現(xiàn)明顯的氧化損傷。與以往研究結(jié)果相似，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)線粒體功能障礙及氧化損傷[14]，這些結(jié)果提示，線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙可能在糖尿病肝損傷中起著關(guān)鍵作用。

線粒體生物合成是線粒體結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的重要生理活動。介導(dǎo)線粒體生成最重要的調(diào)控因子為PGC-1α[15]，對機(jī)體線粒體生物合成及氧化應(yīng)激的調(diào)控具有重要意義。此外，PGC-1α下游轉(zhuǎn)錄因子NRF1和TFAM也是調(diào)控線粒體合成與功能的關(guān)鍵分子，參與線粒體DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[16]。研究顯示，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中，線粒體損傷及ROS的增加與PGC-1α下降密切相關(guān)[17]。2型糖尿病ob/ob小鼠心肌細(xì)胞PGC-1α、NRF1及TFAM表達(dá)顯著降低并伴隨線粒體mtRNA拷貝數(shù)的減少與ROS產(chǎn)生的增加[18]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過乙酰化作用激活PGC-1α從而促進(jìn)線粒體生物合成[19]。然而，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病及db/db糖尿病小鼠模型腎組織中SIRT1表達(dá)與活性均顯著降低，上調(diào)能夠緩解氧化損傷、凋亡等病理改變[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著氧化應(yīng)激及線粒體功能損害，ZDF大鼠肝線粒體生物合成關(guān)鍵分子PGC-1α及其下游NRF1及TFAM的表達(dá)明顯下降，PGC-1α的上游調(diào)控因子SIRT1的表達(dá)也顯著降低，提示ZDF大鼠肝損傷與線粒體生物合成受阻相關(guān)。

近年來，維生素D已成為糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。維生素D經(jīng)肝、腎轉(zhuǎn)化成活性形式1,25(OH)2VD3后與維生素D受體(VDR)結(jié)合，參與糖脂代謝，調(diào)節(jié)胰島素敏感性，在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有重要意義[7]。此外，研究顯示，1,25(OH)2VD3可通過抗氧化、抗炎等多種機(jī)制緩解非酒精性肝損傷。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏會加速和加重ZDF大鼠的病情[21]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，維生素D缺乏狀態(tài)下的ZDF大鼠肝出現(xiàn)了嚴(yán)重的氧化損傷及線粒體損害，1,25(OH)2VD3干預(yù)后肝損傷明顯緩解，ROS產(chǎn)生減少，線粒體結(jié)構(gòu)及功能趨于正常。其他研究也發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2VD3能夠調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體功能及其酶活性[22]。然而，目前關(guān)于1,25(OH)2VD3改善線粒體功能的相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究顯示，1,25(OH)2VD3能夠上調(diào)線粒體生物合成關(guān)鍵蛋白SIRT1、PGC-1α及下游NRF1和TFAM的表達(dá)，修復(fù)ZDF大鼠肝由于高糖高脂引起的線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，同時(shí)緩解了肝氧化損傷。

綜上所述，1,25(OH)2VD3可通過上調(diào)SIRT1/PGC-1α通路增強(qiáng)線粒體生物合成，修復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)與功能，從而緩解了ZDF大鼠肝氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)為1,25(OH)2VD3防治糖尿病及肝損傷提供了新的理論基礎(chǔ)，1,25(OH)2VD3是如何調(diào)控SIRT1及更深入的機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。