曾玉琳，蒙裕歡，張 鈺，杜紅麗*

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006； 2.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663)

大鼠具有體型較大、易于研究以及在某些生理特性方面更接近人類等優(yōu)點，是多種生物醫(yī)學(xué)實驗的首選動物模型。其中，Wistar、GK、BN及SD大鼠作為常用的實驗大鼠模型廣泛應(yīng)用于多種藥物和疾病機(jī)制等研究中。Wistar大鼠于1907年由Wistar研究所培育而來，其引進(jìn)時間較早，遍布范圍較廣，廣泛應(yīng)用于世界各國實驗室中[1]；Goto-Kakizaki(GK)大鼠是1975年由日本東北大學(xué)的Goto和Kakizaki等[2]從Wistar大鼠中篩選高血糖個體近交繁殖數(shù)代而來，具有高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等特性，常用于II型糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究；Brown-Norway(BN)大鼠是Silvers和Billingham于1958年運用此前由野生大鼠培育而成的棕色突變型大鼠近交繁殖而來，其對實驗過敏性腦脊髓炎及自身免疫性復(fù)合型腎小球腎炎有抗性，可作為致敏等動物模型[3-4]；SD大鼠是1925年由美國的Sprague Dawley農(nóng)場用Wistar大鼠培育而成，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和抗病能力，廣泛用于營養(yǎng)學(xué)及病理學(xué)等研究中[5]。

實驗動物的遺傳穩(wěn)定性對實驗的準(zhǔn)確性和可靠性有著一定影響，因此在實驗動物的飼養(yǎng)過程中，對其進(jìn)行定期的遺傳檢測是必不可少的環(huán)節(jié)[6]。生化標(biāo)記基因檢測[7]、免疫標(biāo)記基因檢測[8]以及毛色基因檢測[9]等傳統(tǒng)的遺傳質(zhì)量檢測方法存在著精確度不高以及檢測位點少等局限性，這些檢測方法已不再滿足科學(xué)發(fā)展的需要[10]。隨著基因組學(xué)研究的不斷進(jìn)步，SNP標(biāo)記開始逐漸被應(yīng)用于各種實驗動物的鑒定及遺傳檢測中，相比于傳統(tǒng)的遺傳質(zhì)量檢測方法，利用SNP標(biāo)記具有操作簡單快速、能鑒別出同源品系以及能進(jìn)行大規(guī)模高通量檢測等顯著優(yōu)點[11]。然而，在國內(nèi)外的研究中，應(yīng)用于大鼠遺傳檢測的SNP標(biāo)記的研究卻并不多。Saar等[12]利用3 × 106個SNPs對一系列大鼠進(jìn)行了基因型分析，共發(fā)掘了20 238個有效的SNPs；Guichoux等[13]通過對33 305個已知的候選SNPs進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示其中66%的SNPs能通用于不同大鼠品系中，并另外發(fā)掘了287個新的SNPs；蔡月花等[14]對MIJ和HFJ兩個品系的大鼠進(jìn)行了SNP分析研究，確定了這兩個品系大鼠在9個位點的基因型。

目前，篩查到國內(nèi)外廣泛認(rèn)可的有效遺傳標(biāo)記依然是實現(xiàn)實驗動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)突破的有途徑之一。因此，開發(fā)出能用于大鼠遺傳檢測的SNP標(biāo)記具有重要意義。本文旨在于利用高通量基因組測序、生物信息技術(shù)及一代測序等方法開發(fā)出能用于快速鑒定Wistar、GK、BN和SD這四種常用品系大鼠的SNP位點，以補(bǔ)充大鼠遺傳質(zhì)量檢測方法，并進(jìn)一步完善常用品系大鼠等位基因信息。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠53只，體重170～240 g，1.5月齡；SPF級GK大鼠53只，體重150～220 g，1.5月齡。均購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK (滬) 2017-0005]。SPF級BN大鼠50只，體重70～150 g，1月齡；SPF級SD大鼠50只，體重80～150 g，1月齡。均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0011]。以上大鼠均雌雄各半。大鼠飼養(yǎng)在符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》二級標(biāo)準(zhǔn)的動物房中，恒溫室內(nèi)金屬鼠籠，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，可自由飲水，大鼠的鼠尾組織取材堅持實驗動物使用的3R原則，于廣東省實驗動物監(jiān)測所動物實驗設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK (粵) 2016-0122]，倫理審查編號為IACUC2014029。

1.2 主要試劑與儀器

組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA聚合酶Taq Mix購自TaKaRa寶生物工程有限公司；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送于華大基因測序。PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；DNA電泳儀及電泳槽購自北京六一儀器廠；紫外-可見微量分光光度計購自美國賽默飛世爾科技公司；高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 全基因組重測序

提取3只Wistar大鼠和3只GK大鼠的基因組DNA于華大基因Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行全基因組重測序。

1.3.2 候選SNP的篩查

首先對測序的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行截短和過濾得到待分析數(shù)據(jù)(clean reads)，然后使用Bowtie 2軟件[15]將clean reads比對到BN大鼠參考基因組(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Rat)并生成SAM文件，利用Picard軟件[16]去除PCR重復(fù)，將SAM文件用SAMtools軟件[17]轉(zhuǎn)換成BAM文件并進(jìn)行排序。在Linux系統(tǒng)上，使用SAMtools軟件對上述準(zhǔn)備好的BAM文件及參考基因組建索引，使用GATK軟件[18]的Haplotype Caller工具進(jìn)行SNP檢測并得到相應(yīng)的VCF文件，最后通過閾值篩選得到最終的VCF文件。

經(jīng)過整理統(tǒng)計，Wistar大鼠比對參考序列檢測出94 800個純合SNP，GK大鼠比對參考序列檢測出106 019個純合SNP，其中有56 216個SNP為Wistar和GK大鼠所共有，又對這些共有的SNP進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)BN大鼠參考基因組、Wistar大鼠和GK大鼠三者基因型互不相同的位點僅有38個，從中隨機(jī)挑選了15個作為候選SNP位點(如表1所示)進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3 基因組DNA提取與混合池構(gòu)建

使用組織基因組DNA提取試劑盒提取大鼠鼠尾的基因組DNA。在每種大鼠的DNA樣品中挑10個用于后續(xù)單個個體的PCR擴(kuò)增(分別編號為：BN1～BN10、W1～W10、GK1～GK10、SD1～SD10)，而其余40個則用于合成DNA混合池。對于合成DNA混合池的樣品，先用紫外分光光度計分別對每個DNA樣品的濃度測量3次，取平均值作為樣品濃度值，然后用TE緩沖液稀釋并定量至50 ng/μL，體積為20 μL，每10個同品系大鼠的DNA混合為一個DNA池(例如Wistar大鼠，將編號為W11～W20的DNA樣品混合為W-A，將編號為W21～W30的DNA樣品混合為W-B，將編號為W31～W40的DNA樣品混合為W-C，將編號為W41～W50的DNA樣品混合為W-D)，混合好的16個池用于后續(xù)DNA混合池實驗。

1.3.4 引物設(shè)計與PCR反應(yīng)

提取候選SNP位點上下600 bp序列為模板，使用Primer 6.0分別設(shè)計15對引物(如表2所示)。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次后于72℃充分延伸10 min，最后于4℃保存。

1.3.5 單個個體測序及比對

對于每個品系10只大鼠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別取15 μL進(jìn)行一代測序，然后利用Lasergene軟件包中的SeqMan對測序結(jié)果進(jìn)行整理與比對。根據(jù)四個品系大鼠序列的比對結(jié)果對SNP位點進(jìn)行進(jìn)一步的篩選：①若同品系的10只大鼠在某一SNP位點的基因型不一致，則不采用該SNP；②若GK大鼠和Wistar大鼠在某一SNP位點的基因型與表1不一致，則不采用該SNP；③對于候選SNP位點上下游序列，若出現(xiàn)能鑒別出某種大鼠的SNP位點，則挑選采用。

注：“AA”、“GG”、“TT”、“CC”為基因型。

Note. “AA”, “GG”, “TT”, and “CC” refer to genotypes.

表2 候選SNP位點對應(yīng)的引物信息

1.3.6 DNA混合池實驗

對最終篩選的位點進(jìn)行擴(kuò)大樣本的DNA混合池實驗，以上述準(zhǔn)備好的16個混合池為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同上。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用SeqMan對序列結(jié)果進(jìn)行整理與比對，并查看測序情況。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

以W1～W10，GK1～GK10，BN1～BN10和SD1～SD10為模板，用設(shè)計的15對引物擴(kuò)增目的片段。結(jié)果顯示，第7對和第11對引物擴(kuò)增失敗，其余產(chǎn)物均擴(kuò)增成功且可用于測序。

2.2 單個個體測序及比對結(jié)果

擴(kuò)增成功的產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，滿足上述篩選要求的位點有SNP4、SNP5、SNP6、SNP9、SNP12、SNP13、SNP14。除此之外，在這些序列中還發(fā)掘了其他可以用于快速鑒定的6個位點，分別命名為SNP16、SNP17、SNP18、SNP19、SNP20、SNP21。這13個位點在四種大鼠中的等位基因型如表3所示。

2.3 DNA混合池實驗結(jié)果

對于上述13個SNP位點，DNA混合池的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，除SNP13和SNP16在SD大鼠中出現(xiàn)套峰外(如圖1所示)，其他位點均未出現(xiàn)套峰。SNP13在SD大鼠單個個體測序結(jié)果中10個個體都是雜合子，因此在混合池測序時出現(xiàn)套峰屬于正?，F(xiàn)象，而SNP16在SD大鼠中出現(xiàn)輕微G峰，說明SD大鼠群體中存在少數(shù)AG雜合子或GG純合子的個體。

3 討論

本研究首先利用高通量基因組測序和生物信息技術(shù)篩選了一組候選SNP位點，并繼續(xù)擴(kuò)大樣本量以及增加大鼠種類進(jìn)行測序分型，利用了一代測序?qū)λ姆N大鼠(Wistar、GK、BN、SD大鼠)的候選SNP位點進(jìn)行進(jìn)一步篩查與驗證，最終得到了13個SNP位點以用于四種大鼠的快速鑒定，最后利用DNA混合池法驗證了這些位點在群體中的穩(wěn)定性和用于鑒定的可靠性。

表3 13個SNP位點在四種大鼠中的基因型

注：“AA”、“GG”、“TT”、“CC”為基因型；“—”為堿基缺失。

Note. “AA”, “GG”, “TT”, and “CC” refer to genotypes; “—”refers to base deletion.

注：“W”、“GK”、“BN”、“SD”分別代表Wistar大鼠、GK大鼠、BN大鼠和SD大鼠；A～D分別代表四個DNA混合池。圖1 混合池擴(kuò)增產(chǎn)物的測序峰圖Note. “W”, “GK”, “BN”, and “SD” refer to Wistar, GK, BN, and SD rats, respectively; A-D refer to the four DNA pools, respectively.Figure 1 Sequencing peak maps of DNA pooling amplification products

從這13個SNP位點在四種大鼠中的基因型可以發(fā)現(xiàn)，SNP13可鑒別出Wistar、GK、BN和SD四種大鼠，SNP16和SNP17可鑒別出SD大鼠，SNP18和SNP19可鑒別出GK大鼠，SNP20和SNP21可鑒別出BN大鼠，而SNP4、SNP5、SNP6、SNP9、SNP12和SNP14雖然可鑒別出GK和BN大鼠，但區(qū)分不出Wistar和SD大鼠，主要是Wistar大鼠和SD大鼠這兩個品系親緣關(guān)系較近的緣故，因此可以利用多個位點配合進(jìn)行鑒別，例如，SNP4和SNP17結(jié)合也可快速鑒別出四種大鼠。此外，增加檢測的SNP位點個數(shù)會大大提高鑒別的準(zhǔn)確性和可靠性。

混合池實驗顯示，SNP13和SNP16在SD大鼠中出現(xiàn)了套峰。SNP13在SD大鼠單個個體測序結(jié)果中10個個體都是雜合子，而SNP16在SD大鼠中出現(xiàn)輕微G峰，說明在SD大鼠群體中存在少數(shù)AG雜合子或GG純合子的個體，這些現(xiàn)象是由于SD大鼠作為封閉群在這些位點保持著一定的雜合性。鑒于以上結(jié)果，SNP13和SNP16還可以作為SD大鼠封閉群遺傳評估的SNP標(biāo)記，其他未出現(xiàn)套峰的位點說明了在四個大鼠群體中已趨于穩(wěn)定，用于鑒定物種具有可靠性。

實驗動物的遺傳質(zhì)量是衡量其品質(zhì)好壞的重要因素，使用遺傳特性穩(wěn)定的實驗動物才能保證實驗結(jié)果更加具有可靠性和可重復(fù)性[19]。在生物醫(yī)學(xué)研究中，使用具有明確遺傳背景的實驗動物是非常重要的[20]，因此，篩查到能監(jiān)測實驗動物遺傳背景的標(biāo)記至關(guān)重要。SNP是基因組中最為豐富且最為常見的可遺傳變異，SNP標(biāo)記也將成為用于大鼠遺傳質(zhì)量監(jiān)測的理想遺傳標(biāo)記[21]。目前應(yīng)用于大鼠遺傳檢測的SNP標(biāo)記的研究較少，對其展開研究并篩選能快速鑒定四種常見品系大鼠的SNP位點，以補(bǔ)充大鼠遺傳質(zhì)量檢測手段，具有進(jìn)一步豐富大鼠SNP數(shù)據(jù)庫的重要意義。